Vacuna.

Una vacuna que comprende una proteína secretada derivada de una cepa de vacuna Weybridge de Mycobacerium avium subsp.

paratuberculosis (M. ptb) que está sustancialmente libre de organismos enteros de esta especie vivos o muertos, en la que la proteína secretada se refiere a proteínas presentes en el sobrenadante de cultivos de organismos de M. ptb cultivados en fase semilogarítmica y después de centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g.

Vacuna.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a vacunas que comprenden proteínas de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.

TÉCNICA ANTERIOR

La enfermedad de Johne (paratuberculosis) es una infección contagiosa crónica con el bacilo de tinción acidorresistente Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) . La enfermedad afecta a rumiantes y se caracteriza por emaciación y diarrea intermitente o reblandecimiento de las heces. La enfermedad de Johne es una enfermedad importante en vacas, ovejas, cabras, ciervos y camellos (Beeman y col., The Compendium 11, 1415 (1989) ) .

El tratamiento preferido en la actualidad se basa en una vacuna de microorganismos vivos (Neoparasec, Merial) . Esta vacuna contiene organismos vivos de la cepa Weybridge, una cepa atenuada de M. ptb. También se conocen vacunas inactivadas.

Las vacunas existentes presentan dos desventajas. Las carcasas de animales tratados con las vacunas contienen organismos enteros que no son fácilmente distinguibles de los organismos de la tuberculosis. Además, los dos tipos de vacunas dejan lesiones en el sitio de inyección que pueden confundirse fácilmente con lesiones de tuberculosis.

Un objeto de la presente invención es preparar una vacuna contra la enfermedad de Johne en la que las desventajas anteriores no estén presentes o se hayan reducido.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto la invención proporciona una vacuna que comprende una proteína secretada derivada de una cepa de vacuna Weybridge de Mycobacerium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) que está sustancialmente libre de organismos enteros de esta especie vivos o muertos, en la que la proteína secretada se refiere a proteínas presentes en el sobrenadante de cultivos de organismos de M. ptb cultivados en fase semilogarítmica y después de centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g. Preferentemente no hay organismos de M. ptb. La vacuna de la invención puede usarse para tratar la enfermedad de Johne.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una vacuna contra la enfermedad de Johne que comprende un sobrenadante de una cepa de vacuna Weybridge de cultivo de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis M. ptb que puede obtenerse mediante cultivo en fase semilogarítmica y centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g y el sobrenadante no contiene organismos enteros de esta especie, ni vivos ni muertos.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de una proteína secretada según se define anteriormente, para la preparación de un medicamento con el fin de vacunar a un animal contra Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un sobrenadante de una cepa de vacuna Weybridge de cultivo de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) que puede obtenerse por cultivo de M. ptb en fase semilogarítmica y centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g de manera que el sobrenadante no contiene organismos enteros de esta especie ni vivos ni muertos, para la preparación de un medicamento con el fin de vacunar a un animal contra Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que comprende proteína secretada derivada de una cepa de vacuna Weybridge de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) que está sustancialmente libre de organismos enteros de esta especie, vivos o muertos, para su uso en la vacunación de un animal contra Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, en la que la proteína secretada se refiere a proteínas presentes en un sobrenadante de un cultivo en fase semilogarítmica de los organismos de M. ptb después de centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una vacuna que comprende un sobrenadante de un cultivo de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) que no contiene organismos enteros de esta especie, ni vivos ni muertos, que puede obtenerse mediante cultivo en fase semilogarítmica y centrifugación del cultivo durante 10 minutos a 10.000 g para vacunar a un animal contra Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) .

El término "sustancialmente libre" indica que el número de organismos vivos o muertos es demasiado bajo para tener importancia en el procedimiento de vacunación (por ejemplo, menor que 1.000/ml) .

Preferentemente la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante.

Preferentemente la vacuna comprende una albúmina sérica, más preferentemente una albúmina sérica heteróloga. Para las ovejas la albúmina preferida en la actualidad es albúmina sérica bovina. Para las vacas se prefiere el uso de albúmina sérica ovina.

Preferentemente cuando las proteínas secretadas se obtienen de un cultivo de microorganismos, los microorganismos se eliminan por centrifugación y posteriormente se filtran para eliminar las bacterias residuales.

Preferentemente las proteínas secretadas se concentran usando ultrafiltración.

El término "proteínas secretadas" en la presente memoria descriptiva se refiere a proteínas presentes en el sobrenadante después de la centrifugación durante 10 min a 10.000 g de un cultivo de organismos de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Además de proteínas exportadas el sobrenadante incluye proteínas que se han desprendido de los microorganismos o que están presentes en el cultivo como consecuencia de otras causas. Los animales para los cuales el procedimiento de la invención resulta especialmente útil incluyen los rumiantes, en particular las ovejas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La fig. 1 es un gráfico que muestra isocitrato deshidrogenasa (ICD) en FC concentrado y en sonicados celulares representados con respecto a DO600.

La fig. 2 es una copia de un gel de SDS-PAGE de medio de cultivo (calle 2) y FC (calle 3) .

La fig. 3 es un gráfico que muestra el interferón gamma producido en las muestras de sangre de seis animales vacunados y tres animales de control en respuesta a DPP de johnina y antígenos de vacuna candidatos.

La fig. 4 es un gráfico que muestra el interferón producido en muestras de sangre tomadas de animales no vacunados y animales vacunados con Neoparasec, Filtrado de Cultivo (FC) más Adyuvante de Neoparasec (ANP) y medio más ANP, en respuesta a DPP aviar y FC.

La fig. 5 es un gráfico que muestra el interferón producido en muestras de sangre tomadas de animales no vacunados y animales vacunados con Neoparasec y FC más adyuvante de Neoparasec, en respuesta a DPP aviar, DPP de johnina y antígeno de FC.

La fig. 6 es un gráfico de respuesta media de interferón gamma a DPP aviar con respecto al número de meses después de la vacunación.

La fig. 7 es un gráfico de respuesta media de interferón gamma a FC con respecto al número de meses después de la vacunación.

EJEMPLOS

Los Ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la práctica de la invención.

EJEMPLO I

Se realizaron estudios con corderos Romney macho castrados de tres meses de edad obtenidos de Massey Agricultural Services, Palmerston North, Nueva Zelanda. Los animales se mantuvieron en terrenos de explotación ganadera con pasto al aire libre y agua ad libitum. Las ovejas usadas en este estudio se seleccionaron basándose en la reactividad negativa con el antígeno micobacteriano de DPP de johnina, según la medición con el kit de ensayo de IFN-de sangre entera BOVIGAM (CSL) .

Antígeno de FC

Se preparó Filtrado de Cultivo (FC) de antígeno de vacuna de Johne candidato, que contenía proteínas secretadas de M. ptb, a partir de cultivos de medios líquidos de cepa de vacuna Weybridge de M. ptb (Neoparasec) . Se desarrollaron los cultivos en fase semilogarítmica temprana y se eliminaron las células por centrifugación. Se filtraron los sobrenadantes resultantes (que contenían proteínas secretadas por M. ptb) para eliminar las bacterias residuales y se concentraron aproximadamente 200 veces usando ultrafiltración.

Se cuantificaron muestras de control de FC y sólo de medio (M) usando un ensayo de proteínas y se diluyeron apropiadamente en Solución Salina con Tampón de Fosfato (PBS) . Se estima que del 5 al 10% del FC total es proteína secretada de M. ptb, siendo el resto albúmina sérica bovina (BSA) .

Cultivos de M. ptb y cuantificación de ICD

La cepa de referencia Weybridge 316F de M. ptb se obtuvo de Rhone-Merieux en forma liofilizada y se rehidrató en caldo Middlebrook 7H9 (Difco) , suplementado con 1 mg/l de micobactina J (Allied Monitor) , bactoglicerol al 0, 2% (Difco) , Enriquecimiento... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna que comprende una proteína secretada derivada de una cepa de vacuna Weybridge de Mycobacerium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) que está sustancialmente libre de organismos enteros de esta especie vivos o muertos, en la que la proteína secretada se refiere a proteínas presentes en el sobrenadante de cultivos de organismos de M. ptb cultivados en fase semilogarítmica y después de centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g.

2. Una vacuna según la reivindicación 1, que comprende un adyuvante.

3. Una vacuna según la reivindicación 1 ó 2, que comprende una albúmina sérica.

4. Una vacuna según la reivindicación 2, en la que las proteínas secretadas se obtienen de un cultivo de microorganismos, siendo los microorganismos eliminados por centrifugación y posterior filtración.

5. Una vacuna contra la enfermedad de Johne que comprende un sobrenadante de una cepa de vacuna Weybridge de cultivo de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) obtenida por cultivo en fase semilogarítmica y centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g y el sobrenadante no contiene organismos enteros de esta especie, vivos o muertos.

6. El uso de una proteína secretada según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento para vacunar a un animal contra Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.

7. El uso de un sobrenadante de una cepa de vacuna Weybridge de cultivo de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) obtenido por cultivo de M. ptb en fase semilogarítmica y centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g de manera que el sobrenadante no contiene organismos enteros de esta especie, vivos o muertos, para la preparación de un medicamento para vacunar a un animal contra Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis.

8. El uso según la reivindicación 7, en el que el medicamento comprende un adyuvante.

9. El uso según la reivindicación 7 u 8, en el que el medicamento comprende una albúmina sérica.

10. El uso según la reivindicación 7, en el que el sobrenadante se obtiene de un cultivo de microorganismos, siendo los microorganismos eliminados por centrifugación y posterior filtración.

11. El uso según la reivindicación 6 ó 7, en el que el animal es un rumiante.

12. Un uso según la reivindicación 11, en el que el rumiante es una oveja.

13. Una vacuna que comprende proteína secretada derivada de una cepa de vacuna Weybridge de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) que está sustancialmente libre de organismos enteros de esta especie, vivos o muertos, para su uso en la vacunación de un animal contra Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, en la que la proteína secretada se refiere a proteínas presentes en el sobrenadante de un cultivo en fase semilogarítmica de los organismos de M. ptb después de centrifugación durante 10 minutos a 10.000 g.

14. Una vacuna que comprende un sobrenadante de un cultivo de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) que no contiene organismos enteros de esta especie, ni vivos ni muertos, obtenida por el cultivo en fase semilogarítmica y la centrifugación del cultivo durante 10 minutos a 10.000 g con el fin de vacunar a un animal contra Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. ptb) .