Vacuna del virus de la diarrea viral infecciosa bovina.

Una vacuna que comprende un virus de BVD de tipo 1 atenuado, en donde la actividad de RNasa en su proteínaERNS está inactivada,

combinada con un virus de BVD de tipo 2 atenuado, en donde la actividad de RNasa en suproteína ERNS está inactivada, y un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque dichovirus de BVD de tipo 1 atenuado y dicho virus de BVD de tipo 2 atenuado se han producido por un método para laatenuación de BVDV, que comprende la mutación de un clon de BVDV en las posiciones de histidina 300 y/o 349 dela ERNS, en donde el triplete codificante está suprimido o sustituido, y en donde el virus de BVD de tipo 2 atenuado escodificado por una secuencia de nucleótidos que es SEQ ID Nº 1, pero en donde el codón histidina en la posición300 y/o 349 de la ERNS está suprimido o sustituido.

Vacuna del virus de la diarrea viral infecciosa bovina

Campo de la invención La invención pertenece al campo de la salud animal y, en particular, al Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) . La invención proporciona clones infecciosos del BVDV y métodos para producir dichos clones de BVDV. La invención se refiere, además, a métodos para atenuar dichos clones, a clones de BVDV atenuados y a vacunas que comprenden dichos clones atenuados.

Antecedentes de la invención El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) es el agente causante de la BVD y de la enfermedad mucosa en el ganado (Baker, 1987; Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996) . La infección fetal durante la preñez puede dar como resultado la resorción del feto, abortos, así como el nacimiento de terneros inmuno-tolerantes que están persistentemente infectados con BVDV. Estos terneros carecen o tienen títulos muy bajos de anticuerpos neutralizantes y expulsan continuamente grandes cantidades del virus. Junto con el ganado con infección aguda, estos terneros son la fuente principal de difusión del virus y son, por tanto, de enorme importancia en la epidemiología de esta enfermedad. El fuerte impacto económico de la BVD es consecuencia de los elevados índices de aborto, nacimientos de animales muertos, resorción fetal, momificación, malformaciones congénitas y nacimientos de terneros débiles y de tamaño menor al normal. Para una revisión detallada de la patogenia, se hace referencia aquí al artículo de Moennig y Liess de 1995.

Se han descrito dos principales grupos antigénicos de BVDV (tipos 1 y 2) (Becher et al., 1999) , que muestran limitadas reacciones cruzadas de anticuerpos neutralizantes (Ridpath et al., 1994) . Las actuales vacunas para la prevención y tratamiento de las infecciones por BVDV siguen teniendo inconvenientes (Oirschot et al., 1999) . Las vacunas contra el tipo 1 clásico del BVDV ofrecen sólo una protección parcial frente a la infección por tipo 2 y las vacas vacunadas pueden parir terneros que están persistentemente infectados con el BVDV tipo 2 virulento (Bolin et al., 1991, Ridpath et al., 1994) . Este problema tiene probablemente su origen en la gran diversidad antigénica entre las cepas de tipo 1 y tipo 2, que es más pronunciada en la glicoproteína E2, el principal antígeno (Tijssen et al., 1996) : la mayor parte de los anticuerpos monoclonales contra las cepas del tipo 1 fracasa en su unión a virus del tipo 2 (Ridpath et al., 1994) .

Las vacunas de virus muertos (virus completo inactivado) o las vacunas de sub-unidades (proteínas virales purificadas de forma convencional o expresadas de manera heteróloga) son, con mucha frecuencia, inferiores a las vacunas de virus vivos en lo que respecta a su eficacia para producir una inmunorrespuesta de protección completa, incluso en presencia de coadyuvantes.

Las vacunas de BVDV vivos, aunque atenuadas, se asocian con gran frecuencia a problemas de seguridad. Como se ha mencionado anteriormente, atraviesan la placenta de las vacas preñadas y dan lugar a manifestaciones clínicas en el feto y/o a la inducción de terneros persistentemente infectados. Por lo tanto, no se pueden aplicar al ganado de cría que contenga vacas preñadas. Las vacas preñadas se deben mantener separadas del ganado vacunado para proteger los fetos y no deben ser vacunadas. Adicionalmente, los elementos de reversión de los BVDV vivos atenuados representan una grave amenaza para el ganado. Para los virus atenuados derivados de forma convencional, en los que la atenuación se consigue por múltiples pasajes convencionales, el origen molecular y la estabilidad genética de la atenuación siguen siendo desconocidos y la reversión al tipo salvaje virulento es impredecible.

Las vacunas vivas con mutaciones definidas, como base de la atenuación, superarían los inconvenientes de la presente generación de vacunas atenuadas. Otra ventaja de dichas mutaciones atenuantes radica en su unicidad molecular definida, que se puede utilizar como marca distintiva para los pestivirus atenuados, con el fin de distinguirlos de los pestivirus de campo.

El documento WO 01/39801 describe que la supresión del codón para histidina en la posición 349 del gen ERNS de la cepa CP7 de BVDV tipo 1 resulta en una cepa BVDV recombinante que es adecuada como una vacuna contra infección por BVDV-1.

En la técnica, son escasamente conocidos BVDV de identidad genética definida que se asemejen a los virus de tipo salvaje, sobre todo para el BVDV de tipo 2. En la técnica, existe una prolongada necesidad de métodos que generen tales BVDV. Por consiguiente, un problema técnico que subyace a esta invención era proporcionar un BVDV, en particular un BVDV tipo 1 en unión con un BVDV de tipo 2, de identidad genética definida.

Descripción de la invención Definiciones de los términos usados en la descripción:

Frente a las realizaciones de la presente invención, es preciso destacar que, tal como se usa aquí y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares “uno, una, el y la” incluyen también referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “un virus BVDV” incluye una pluralidad de tales virus BVDV, la referencia a la “célula” es una referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidos para los expertos en la técnica, etc. A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen los mismos significados que los habituales para un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aun cuando se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos aquí en la práctica o comprobación de la presente invención, los métodos, dispositivos y materiales preferidos son los que se describen a continuación. Todas las publicaciones aquí mencionadas se incorporan como referencia al objeto de describir y revelar las líneas celulares, vectores y metodologías sobre las que se informa en las publicaciones que se pueden utilizar en relación con la invención. Nada de lo aquí reseñado se puede entender como admisión de que la invención no está autorizada para adelantarse a dicha descripción en virtud de invenciones anteriores.

El término “BVDV”, tal como se usa aquí, se refiere a todos los virus pertenecientes a las especies BVDV1 y BVDV2 en el género pestivirus, dentro de la familia Flaviviridae (Becher et al., 1999) . Las cepas BVDV tipo 1, más clásicas, y las cepas BVDV tipo 2, más recientemente descubiertas, muestran algunas diferencias limitadas, pero distintivas, en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos.

Un “clon” es un vector de DNA o una cepa de célula huésped en la que se ha introducido ese vector. Preferentemente, el vector de DNA es un plásmido.

Un “clon infeccioso” es un vector de DNA con la capacidad de servir como modelo para la transcripción en un RNA que induce la generación del virus cuando se introduce en células susceptibles. Preferentemente, el RNA se produce por transcripción in vitro y se introduce e las células por tecnologías de transfección conocidas para el experto en la materia.

“Partículas de BVDV” o “partículas virales”, como se usa aquí, hacen referencia a virus de BVD generados por “clones infecciosos” a través de RNA, que inducirá la producción de tales partículas de BVDV cuando se introduzca en células susceptibles. “Partículas de BVDV atenuado” o “partículas virales atenuadas”, como se usa aquí, se refieren a partículas de BVDV atenuadas por un método según la invención (véase más adelante) .

“Infectividad” es la capacidad de un virus o partícula viral para inducir un determinado número de placas en un ensayo de placa o una cierta puntuación de TCID50 en un ensayo de punto final.

Un RNA de longitud total es un RNA que comprende al menos 98% de la secuencia de un RNA que se manifiesta en un aislado de tipo salvaje. Un DNA complementario de longitud total es un DNA que comprende una secuencia complementaria a al menos 98% de un RNA que se manifiesta en un aislado de tipo salvaje.

Como se usa aquí, “ternero” se refiere a un animal bovino de seis meses de edad o menos.

Virulencia: “Virulencia auténtica”, como se usa aquí, significa que no existen diferencias estadísticamente significativas entre la virulencia de partículas infecciosas de BVDV, según la invención, y aislados de tipo salvaje de BVDV del que se han derivado dichas moléculas de DNA que contienen una secuencia de nucleótidos complementaria al RNA de BVDV, preferentemente un RNA de... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna que comprende un virus de BVD de tipo 1 atenuado, en donde la actividad de RNasa en su proteína ERNS está inactivada, combinada con un virus de BVD de tipo 2 atenuado, en donde la actividad de RNasa en su proteína ERNS está inactivada, y un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque dicho virus de BVD de tipo 1 atenuado y dicho virus de BVD de tipo 2 atenuado se han producido por un método para la atenuación de BVDV, que comprende la mutación de un clon de BVDV en las posiciones de histidina 300 y/o 349 de la ERNS, en donde el triplete codificante está suprimido o sustituido, y en donde el virus de BVD de tipo 2 atenuado es codificado por una secuencia de nucleótidos que es SEQ ID Nº 1, pero en donde el codón histidina en la posición 300 y/o 349 de la ERNS está suprimido o sustituido.

2. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho virus de BVD de tipo 1 atenuado y dicho virus de BVD de tipo 2 atenuado se han producido por un método para la atenuación de BVDV, que comprende la mutación de un clon de BVDV en las posiciones de histidina 300 y/o 349 de la ERNS, en donde los tripletes codificantes están suprimidos o sustituidos.

3. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un virus de BVD de tipo 1 atenuado, en donde la actividad de RNasa en su proteína ERNS está inactivada por una deleción del codón histidina 349 de la ERNS, combinado con un virus de BVD de tipo 2 atenuado, en donde la actividad de RNasa en su proteína ERNS está inactivada por una deleción de histidina 349 de la ERNS, y un soporte o excipientes farmacéuticamente aceptables.

4. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende un virus de BVD de tipo 1 atenuado, en donde la actividad de RNasa en su proteína ERNS está inactivada por una sustitución del codón histidina 300 de la ERNS por leucina, combinado con un virus de BVD de tipo 2 atenuado, en donde la actividad de RNasa en su proteína ERNS

ERNS

está inactivada por una sustitución de histidina 300 de lapor leucina, y un soporte o excipientes farmacéuticamente aceptables.