Utilización de péptido de soja (lunasina) para reducir la tasa de colesterol total y LDL.

Una composición que comprende un compuesto seleccionado del grupo consistente del péptido de SEQ ID NO 2 y una variante,

fragmento o análogo funcionalmente equivalente de dicho péptido para uso en el tratamiento de altos niveles de colesterol en un individuo.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención hace referencia generalmente a composiciones para usar en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el colesterol en individuos. Más específicamente, esta invención hace referencia a una clase de péptidos que proporcionan a los individuos diversos beneficios relacionados con la salud y a composiciones que los comprenden. Más específicamente, esta invención hace referencia a novedosas composiciones que comprenden péptidos de soja, métodos de usar estas composiciones para reducir los niveles de colesterol total y LDL en individuos y métodos para preparar composiciones que los comprenden.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad coronaria (EC) es un importante problema sanitario en los EE. UU. con tasas de mortalidad que superan 1 millón anualmente. Los factores de riesgo incluyen fumar cigarrillos y la hipertensión, pero el colesterol plasmático elevado también ha sido involucrado como el factor de riesgo primario para la EC. Los niveles elevados de colesterol total y colesterol lipoproteína de baja densidad (LDL) contribuyen a la formación de placas ateroscleróticas y eventualmente a trombosis o infarto de miocardio. Por ello el control de los niveles de colesterol es una parte esencial de las estrategias de prevención y tratamiento para reducir la incidencia, mortalidad y morbilidad de la enfermedad coronaria.

Existe una evidencia epidemiológica sustancial de que los factores dietéticos, tales como el consumo de determinadas proteínas de soja pueden ayudar a controlar los niveles de colesterol y a reducir el riesgo de EC en determinados individuos. Algunos estudios epidemiológicos han mostrado que el consumo de alimentos de soja está relacionado con un riesgo reducido de enfermedad cardiovascular en algunas poblaciones asiáticas (1) . Más recientemente, un estudio a gran escala, de 3 años, de un grupo de 75.000 mujeres chinas ha mostrado una relación dosis -respuesta entre la ingesta de alimentos de soja y el riesgo reducido de enfermedad coronaria, especialmente del infarto de miocardio no fatal (2) . Los resultados del metaanálisis de 38 estudios clínicos que incluyeron 730 voluntarios a estudio, mostraron que la ingesta de proteína de soja estaba asociada con una reducción del 9, 3% del colesterol sérico, una reducción del 12, 9% en el colesterol LDL sérico, una reducción del 10, 5% de los triglicéridos séricos y un incremento no significativo en los niveles de lipoproteína de alta densidad (HDL) (3) . Los resultados clínicos de los experimentos que involucran proteína de soja han motivado que la Food and Drug Administration (FDA) permita una afirmación sanitaria en las etiquetas de alimentos declarando que 25 gramos de proteína de soja como parte de la dieta diaria baja en grasas saturadas y colesterol puede reducir el riesgo de enfermedad cardiaca.

Los componentes de la soja candidatos que podrían contribuir a su efecto hipocolesterolémico incluyen las proteínas de soja y sus componentes no proteínicos, saponinas e isoflavonas, genisteína y daidzeína. Lamentablemente, el cuerpo de datos experimentales indica que aún no está claro cuál de estos componentes proporciona efectos hipocolesterolémicos. Muchos han propuesto la hipótesis de que las isoflavonas de la soja son las responsables de reducir los niveles de colesterol en animales (4-6) y en la especie humana (7-8) . Notablemente, estos y otros estudios muestran que las isoflavonas de soja no proporcionan efectos reductores del colesterol. Por ejemplo, en un estudio, cuando extracto de soja rico en isoflavonas fue suministrado a monos cangrejeros en ausencia de proteína de soja no produjo efectos reductores del colesterol (9) .

En algunos estudios, cuando simplemente se añadió proteína de soja a la dieta del animal se observaron reducciones significativas en el colesterol (10) . El interés acerca de un mecanismo de acción cardioprotector viable atribuible a las isoflavonas (11-13) también ha moderado el entusiasmo acerca del papel de las isoflavonas en la reducción del riesgo de EC. Las saponinas, un grupo estructuralmente diferente de glucósidos triterpénicos o esteroideos, también han sido propuestas por su actividad hipocolesterolémica (14) . Sin embargo, no hay estudios convincentes en animales o en la especie humana así como mecanismo de acción viable que indique que las saponinas son las responsables de la actividad hipocolesterolémica de la soja. Lo mismo es cierto con las globulinas 7S, una importante proteína de almacenamiento de la soja que se encontró que inhibe la aterosclerosis en ratones pero no mostró efectos hipocolesterolémicos (15) .

En febrero de 2006, la American Heart Association publicó un informe científico consultivo sobre la proteína de soja, las isoflavonas y la enfermedad cardiovascular analizando recientes datos clínicos publicados desde la alegación sanitaria aprobada por la FDA (16) . Entre 19 estudios de isoflavonas de soja, la American Heart Association encontró que las isoflavonas, por término medio, no tienen efecto sobre el colesterol Lipoproteína de Baja Densidad (“colesterol LDL”) u otros factores de riesgo lipídicos. El informe concluye que “Una cantidad muy grande de proteína de soja, más de la mitad de la ingesta diaria de proteínas, puede reducir el colesterol LDL en unos pocos puntos porcentuales cuando sustituye a la proteína dietaria de una mezcla de

proteínas animales. La evidencia favorece la proteína de soja en vez de las isoflavonas de soja como el nutriente responsable. Sin embargo, en este momento, no se puede descartar la posibilidad de que otro componente del haba de soja pudiera ser el factor activo. Por consiguiente, todavía no está claro qué componente o componentes de la proteína de soja proporcionan los efectos beneficiosos de reducción del colesterol que reducen el riesgo de EC. En consecuencia, los métodos actuales de reducir el colesterol usando proteína de soja han proporcionado resultados variables que ni están enfocados ni son altamente efectivos.

Un inconveniente adicional para el uso de los productos de soja descritos en las pruebas clínicas anteriores y avalados por la FDA, es la gran cantidad (25 mg/día) de producto de soja que se requiere para obtener un resultado beneficioso. Sería deseable tener una composición más concentrada que hiciera más fácil obtener niveles suficientes de la parte deseada del producto de soja, así como hacer la preparación y el envasado de dichos productos de soja más factibles.

Aunque US 2003/0027765A1, US 6391848A y US6107287A declaran composiciones farmacéuticas que comprenden lunasina, en particular para el tratamiento del cáncer, existe una necesidad de composiciones mejoradas y métodos relacionados para reducir con efectividad el colesterol total y LDL en individuos. La presente invención proporciona estos y otros beneficios relacionados.

DEFINICIONES

Para facilitar una comprensión de la invención, se definen varios términos y frases a continuación. A menos que se definan de otro modo, todos los términos de la técnica, notaciones y otra terminología científica usada en el presente documento, se pretende que tengan los significados corrientemente entendidos por los versados en la técnica a la que pertenece esta invención. En algunos casos términos con significados corrientemente entendidos se definen en el presente documento por claridad y/o referencia rápida y la inclusión de dichas definiciones en el presente documento no debe ser interpretada necesariamente como que representa una diferencia sustancial con la que es generalmente entendida en la técnica. Las técnicas y los procedimientos generales descritos o referenciados en el presente documento son generalmente bien entendidos y corrientemente empleados usando metodología convencional por los versados en la técnica. Según proceda, los procedimientos que implican el uso de kits y reactivos disponibles comercialmente se realizan generalmente de acuerdo con los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique lo contrario.

Tal y como se usa en este documento, el número singular de los artículos definido e indefinido incluye las referencias al plural a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo “un” inhibidor de la enzima proteasa incluye uno o más inhibidores de la enzima proteasa.

Tal y como se usan en este documento “ug” es una abreviatura de microgramo y “uM” es una abreviatura de micromol.

Tal y como se usan en este documento, “actividad biológica” y “bioactividad” hacen referencia a las actividades in vivo de un compuesto o a las respuestas fisiológicas que resultan de la administración... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un compuesto seleccionado del grupo consistente del péptido de SEQ ID NO 2 y una variante, fragmento o análogo funcionalmente equivalente de dicho péptido para uso en el tratamiento de altos niveles de colesterol en un individuo.

2. Una composición para el uso acorde a la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de enfermedad cardiovascular en un individuo que sufre de o está en riesgo de desarrollar enfermedad cardiovascular.

3. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho compuesto se obtiene del haba de soja, trigo o cebada.

4. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho compuesto se obtiene produciendo, extrayendo y purificando dicho compuesto usando técnicas de ADN recombinante, o en la que dicho compuesto se obtiene por producción sintética del polipéptido.

5. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho individuo es de la especie humana, y especialmente en la que la composición se proporciona para ingestión oral.

6. La composición para el uso de la reivindicación 1 o 2, en la que la composición está en la forma de una cápsula, tableta, polvo, formulación semisólida, líquido, gel, suspensión, o pulverización por aerosol.

7. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que dicha composición comprende además inhibidor de quimotripsina y/o harina de soja.

8. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho compuesto es suministrado para administración a entre 0, 05 mg/kg y 50 mg/kg diariamente.

9. La composición de la reivindicación 1 o 2, en la que dicho individuo está en riesgo de aterosclerosis, arteriosclerosis, infarto de miocardio, ataque cardíaco, diabetes, enfermedad coronaria, angina de pecho o angina inestable.

FIGURA 1 PROTEÍNA ALBÚMINA 2S CONTENIENDO SUBUNIDAD DE LUNASINA

FIGURA 2

EXPRESIÓN DE LA HMG-CoA REDUCTASA EN MEDIOS SIN COLESTEROL TRATADOS CON LUNASINA

FIGURA 3

EXPRESIÓN DEL RECEPTOR LDL EN MEDIO SIN COLESTEROL TRATADO CON LUNASINA

FIGURA 4

EXPRESION DE SP1 EN MEDIO DE CULTIVO TRATADO CON LUNASINA Y MEDIO SIN COLESTEROL

FIGURA 5

FIGURA 6

FIGURA 7

A = LeSC B = LeSC + SF C = LeSC + SF digerido D = LeSC digerido E = SPI digerido F = SC digerido

FIGURA 8

A = LeSC B = LeSC + SF

FIGURA 9

Inmunotinción de lunasina

FIGURA 10

Ensayo de bioactividad

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citada por el solicitante es solamente para comodidad del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aun cuando se ha tenido mucho cuidado al compilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO renuncia a cualquier responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

• US 20030027765 A1 [0008]

• US 6391848 A [0008]

• US 6544956 A [0008]

• US 6107287 A [0008] [0050]

• US 6544956 B [0050]

• US 20030229038 A [0050]

• US 6391848 B [0050]

• US 25225602 A [0050]

• US 30263302 A [0050]

• US 7235269 B, Konwinski [0130]

• US 4793996 A, Kennedy [0130]

• US 5217717 A [0130]

• US 5505946 A [0130]

• US 20030064121 A, Konwinski [0130]

• US 20070092633 A [0191]

• US 0778584 W [0216]

Bibliografía no patente citada en la descripción

• Biochemistr y , 1972, vol. 11, 1726 [0040]

• Molecular Cloning: A Laborator y Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 [0058]

• Oligonucleotide Synthesis. 1984 [0058]

• Methods in Molecular Biology. Humana Press [0058]

• Cell Biology: A Laborator y Notebook. Academic Press, 1988 [0058]

• Animal Cell Culture. 1987 [0058]

• Introduction to Cell and Tissue Culture. Plenum Press, 1998 [0058]

• Cell and Tissue Culture: Laborator y Procedures. J. Wiley and Sons, August 1993 [0058]

• Methods in Enzymology. Academic Press, Inc, [0058]

• Handbook of Experimental Immunology [0058]

• Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells. 1987 [0058]

• Current Protocols in Molecular Biology. 1987 [0058]

• PCR: The Polymerase Chain Reaction. 1997 [0058]

• Current Protocols in Immunology. 1991 [0058]

• Short Protocols in Molecular Biology. Wiley and Sons, 1999 [0058]

• HELLERSTEIN ; NEESE. Am J Physiol. Endocrinol Metab., 1999, vol. 276 (39) , E1146-E1162 [0058]

• Remington’s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, [0152]

• SCHNITZER-POLOKOFF et al. Comp. Biochem. Physiol., 1991, vol. 99A (4) .

66. 670 [0212]

• ADLERCRUZ H ; MAZUR W. Phyto-oestrogens and Western diseases. Ann. Med., 1997, vol. 29.

9. 120 [0215]

• ZHANG X. ; SHU XO ; GAO YT ; YANG G. ; LI O ; LI H ; JIN F ; ZHENG W. Soy food consumption is associated with lower risk of coronar y heart disease in Chinese women. J. Nutr., 2003, vol. 133, 2874-2878

• ANDERSON JW ; JOHNSTONE BM ; COOK-NEWELL ME. Meta-analysis of effects of soy protein intake on serum lipids in humans. N Eng J Med, 1995, vol. 333.

27. 282 [0215]

• ANTHONY MS ; CLARKSON TB ; HUGHES CL. Soybean isoflavones improve cardiovascular risk factors without affecting the reproductive system of peripubertal rhesus monkeys. J. Nutr., 1996, vol. 126.

4. 50

• ARJMANDI BH ; KHAN DA ; JUMA S ; SVANBORG A. The ovarian hormone deficiency-induced hypercholesterolomia is reversed by soy protein and the synthetic isoflavone, ipriflavone. Nutr. Res., 1997, vol. 17.

88. 894 [0215]

• KIRK EA ; SUTHERLAND P ; WANG SA. Dietar y isoflavones reduce plasma cholesterol and atherosclerosis in C57BU6 mice but not LDL-receptor deficient mice. J. Nutr., 1998, vol. 128.

95. 959 [0215]

• CROUSE JR ; MORGAN T ; TERRY JG. A randomizing trial comparing the effect of casein with that of soy protein containing var y ing amounts of isoflavones on plasma concentrations of lipids and lipoproteins. Arch Intern Med., 1999, vol. 159, 2070-2076 [0215]

• WONG WW ; SMITH EO ; STUFF JE. Cholesterol lowering effect of soy protein in normocholesterolomic and hypercholesterolomic men. Am J Clin Nutr, 1998, vol. 68 (1) , 385S-1389S [0215]

• GREAVES KA ; PARKS JS ; WILLIAMS JK ; WAGNER JD. Intact dietar y soy protein, but not adding an isoflavone-rich soy extract to casein, improves plasma lipids in ovariectomized cynomolgus monkeys. J. Nutr., 1999, vol. 129, 1585-1592 [0215]

• VERRILLO A ; TERESA DE A ; GIARRUSSO PC. Soybean protein diets in the management of type II hyperlipoproteinaemia. Atherosclerosis, 1985, vol. 54, 321 [0215]

• KRIS-ETHERTON P ; WEST SG. Soy protein with or without isoflavones: in search of a cardioprotective mechanism of action. Am J Clin Nutr, 2005, vol. 81, 5-6 [0215]

• ANTHONY MS. Phytoestrogens and cardiovascular disease: Where’s the meat?. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2002, vol. 22, 1245-1257 [0215]

• VEGA-LOPEZ S ; YEUM K-J ; LECKLER JL. Plasma antioxidant capacity in response to diets high in soy or animal protein with or without isoflavones. Am J Clin Nutr, vol. 81.

4. 49 [0215]

• OAKENFULL DG ; SIDHU GS. Could saponins be a useful treatment for hypercholesterolaemia?. Eur J Clin Nutr, 1990, vol. 44.

7. 88 [0215]

• ADAMS MR ; GOLDEN DL ; FRANKE AA ; POTTER SM ; SMITH HS ; ANTHONY MS. Dietar y soy betaconglycinin (7S globulin) inhibits atherosclerosis in mice. J. Nutr., 2004, vol. 134.

51. 516 [0215]

• SACKS FM ; LICHTENSTEIN A. ; VAN HORN L. ; HARRIS W. ; KRIS-ETHERTON P ; WINSTON M. Soy protein, isoflavones and cardiovascular health. An American Heart Association Science Advisor y for Professionals from the Nutrition Committee. Circulation, 21 Februar y 2006 [0215]

• GALVEZ, A.F. ; REVILLEZA, M.J.R. ; LUMEN, B.O. A novel methionine-rich protein from soybean cotyledon: cloning and characterization of cDNA. Circulation, 1997, vol. 114, 1-567 [0215]

• GALVEZ, A.F. ; LUMEN, B.O. A soybean cDNA encoding a chromatin-binding peptide inhibits mitosis of mammalian cells. Nature Biotech., 1999, vol. 17.

49. 500 [0215]

• MEJIA EG ; VASCONEZ M. ; LUMEN BO ; NELSON R. Lunasin concentration in different soybean genotypes, commercial soy protein and isoflavone products. J Agric Food Chem, 2004, vol. 52, 5882-5887 [0215]

• GALVEZ, A.F. ; CHEN, N. ; MACASIEB, J. ; LUMEN, B.O. Chemopreventive property of a soybean peptide. Cancer Res., 2001, vol. 61, 7473-7478 [0215]

• DE PINHO, R.A. The cancer-chromatin connection. Nature, 1998, vol. 391.

53. 536 [0215]

• KUZMIN I. ; GEIL L. DNA methylation and chromatin modifications in cancer and development. Int Arch Biosci, 2001, vol. 2001, 1047-1 056 [0215]

• Nutrient -Gene Interactions Involving Soy Peptide and Chemopreventive Genes in Prostate Epithelial Cells. MAGBANUA M ; DAWSON K ; HUANG L ; MALYJ W ; GREGG J ; GALVEZ A ; RODRIGUEZ RL. Nutritional Genomics -Discovering the Path to Personalized Nutrition. Wiley and Sons, 2005 [0215]

• BENNETT MK ; OSBORNE TF. Nutrient regulation of gene expression by the sterol regulator y element binding proteins: Increased recruitment of gene-specific coregulator y factors and selective hyperacetylation of histone H3 in vivo. PNAS, 2000, vol. 97, 6340-6344 [0215]

• BROWN MS ; GOLDSTEIN JL. Lowering plasma cholesterol by raising LDL receptors. Atherosclerosis, 2004, vol. 5.

5. 59 [0215]

• SIRTORI CR ; GATTI E ; MANTERO O ; CONTI F. et al. Clinical experience with the soybean protein diet in the treatment of hypercholesterolemia. Am J Clin Nutr., 1979, vol. 32, 1645-1658 [0215]

• DESCOVICH GC ; CEREDI C. ; GADDI A. ; BENASSI MS et al. Multicentre study of soybean protein diet for outpatient hyper-cholesterolaemic patients. Lancet, 1980, vol. 2.

70. 712 [0215]

• LAM, Y.; GALVEZ, A. ; LUMEN, B.O. Lunasin suppresses E1A-mediated transformation of mammalian cells but does not inhibit growth of immortalized and established cancer cell lines. Nutrition & Cancer, 2003, vol. 47.

8. 94 [0215]

• COQUERET, O. New roles for p21 and p27 cell-cycle inhibitors: A function for each cell compartment?. Trends in Cell Biology, 2003, vol. 13.

6. 70 [0215]

• BRUZZONE, R. ; WHITE, T. W. ; PAUL, D. L. Connections with connexins: The molecular basis of direct intercellular signaling. European Journal of Biochemistr y , 1996, vol. 238, 1-27 [0215]

• MULLEN E ; BROWN RM ; OSBORNE TF ; SHAY NF. Soy isoflavones affect sterol regulator y element binding proteins (SREBPs) and SREBP-regulated genes in HepG2 cells. J. Nutr., 2004, vol. 134, 2942-2947 [0215]

• GHERARDI E. ; THOMAS K ; LE CRAS TD ; FITZSIMMONS C ; MOORBY CD ; BOWYER DE. Growth requirements and expression of LDL receptor and HMG-CoA reductase in HepG2 hepatoblastoma cells cultured in a chemically defined medium. J Cell Sci., 1992, vol. 103.

53. 539 [0215]

• DI PIETRO CM ; LIENER IE. Soybean protease inhibitors in foods. Journal of Food Science, 1989, vol. 54.

60. 609 [0215]

• JEONG HJ ; LAM Y ; LUMEN BO. Barley lunasin suppresses ras-induced colony formation and inhibits core histone acetylation in mammalian cells. J Agric Food Chem., 2002, vol. 50, 5903-5908 [0215]

• JEONG HJ ; JEONG JB ; KIM DS et al. The cancer preventive peptide lunasin from wheat inhibits core histone acetylation. Cancer Lett., 2007, vol. 255.

4. 48 [0215]

• FRATALLI V. Soybean inhibitors.III. Properties of a low molecular weight soybean protease inhibitor. J Biol Chem, 1969, vol. 274, 280 [0215]

• ODANI et al. Amino acid sequence of a soybean (Glycine max) seed polypeptide having a poly (L-aspartic acid) structure. J Biol Chem, 1987, vol. 262, 10502-10505 [0215]

• KHO, C.J. ; LUMEN, B.O. Identification and isolation of methionine-cysteine rich protein fraction in soybean seed. Plant Foods for Human Nutrition, 1988, vol. 38.

28. 296 [0215]

• REVILLEZA M.J. ; GALVEZ A.F. ; KRENZ D.C. ; LUMEN B.O. An 8 kDa methionine-rich protein from soybean (Glycine max) cotyledon: Identification, purification and N-terminal sequence. J Agric Food Chem, 1996, vol. 44, 2930-2935 [0215]