Utilización de partículas celulares generadas a partir de la recuperación de PHA para crecimiento celular mejorado.

Procedimiento para producir materiales poliméricos biodegradables incluyendo polihidroxialcanoatos (PHA) apartir de una fuente de carbono orgánico,

que comprende:

(a) cultivar células microbianas que producen PHA en una disolución de medio que contiene una fuente decarbono orgánico para formar PHA que se acumulan en las células como cuerpos de inclusión;

(b) recoger las células a partir del medio gastado y solubilizar la masa celular que no es PHA para obtener unsólido de PHA y una disolución de partículas celulares;

(c) separar el sólido de PHA de la disolución de partículas celulares;

(d) suministrar la disolución de partículas celulares a la etapa (a) de cultivo.

Utilización de partículas celulares generadas a partir de la recuperación de PHA para crecimiento celular mejorado.

Antecedentes de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para producir materiales poliméricos biodegradables a partir de una fuente de carbono orgánico, por ejemplo melaza y pulpa de remolacha azucarera. Particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir materiales poliméricos biodegradables incluyendo polihidroxialcanoatos con partículas celulares, un tipo de desecho orgánico que queda de la recuperación y purificación de polihidroxialcanoatos de células.

Los polihidroxialcanoatos (PHA) son homopolímeros o copolímeros de hidroxialcanoatos, tales como 3hidroxibutirato (3HB) , 3-hidroxivalerato (3HV) , 4-hidroxivalerato (4HV) y 3-hidroxihexanoato (3HH) . Estos biopolímeros termoplásticos o elásticos se sintetizan y acumulan por muchos microorganismos, bacterias en particular, como materiales de almacenamiento de carbono y energía. Los PHA se sintetizan convenientemente cultivando las células microbianas en un medio acuoso con una fuente de carbono, incluyendo azúcares, ácidos orgánicos y alcoholes. Dependiendo de las cepas y las condiciones de crecimiento, los biopoliésteres en forma de pequeños gránulos (0, 3-0, 5 om) pueden representar el 50-80% en peso de la masa celular seca.

Los gránulos de PHA deben separarse del resto de la masa celular que no es PHA de modo que los bioplásticos presenten la propiedad material y pureza deseadas. Las partículas celulares residuales de la recuperación de PHA, que consisten en proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y fragmentos de pared, no presentan valor comercial y o bien se desechan como desecho sólido o bien se descargan en el agua residual de procedimiento.

Habitualmente se utilizan dos tecnologías para la recuperación de PHA, basadas o bien en extracción con disolvente orgánico de poliésteres o bien en digestión de la masa celular que no es PHA. En la primera, los gránulos de PHA se disuelven en disolventes orgánicos apropiados, quedando sólidos de partículas celulares. En la segunda, quedan gránulos de PHA como sólidos, pero la masa celular que no es PHA se digiere y se disuelve en disoluciones acuosas con ayuda de agentes biológicos y químicos. Una separación sólido/líquido convencional después de los tratamientos genera una corriente de producto de PHA y otra corriente de partículas celulares que no son PHA. Según la composición celular, las partículas celulares son realmente la verdadera masa celular que contiene todos los componentes esenciales del crecimiento celular, mientras que el PHA de producto sólo es un material de reserva de carbono. Con el fin de producir poliésteres de PHA, deben consumirse suficientes nutrientes (C, N, P, minerales y

factores de crecimiento orgánicos) para hacer crecer suficientes células que a su vez sintetizan biopoliésteres a partir de la fuente de carbono.

La patente U.S. no 7.514.525 se refiere a un procedimiento para recuperar, purificar y aislar biopolímeros de PHA a partir de una masa celular que contiene PHA, que incluye: (a) solubilizar la masa celular que no es PHA en una disolución ácida, quedando una suspensión de gránulos de PHA parcialmente cristalizados; (b) ajustar el pH de la suspensión a 7-11 y separar los sólidos de PHA de la masa celular que no es PHA disuelta; (c) resuspender los sólidos de PHA en una disolución de blanqueamiento para su decoloración; y (d) secar los sólidos de PHA resultantes. Se recupera aproximadamente el 95% o más del PHA original en la masa celular, y la pureza de los sólidos de PHA es de aproximadamente el 97% o superior.

Sumario de la invención.

El solicitante se ha enfrentado al problema de mejorar el rendimiento de un procedimiento para producir PHA a partir de una fuente de carbono orgánico mediante fermentación microbiana. El solicitante también se ha enfrentado al 50 problema de deshacerse de las partículas celulares que quedan de la recuperación y purificación de PHA. El solicitante ha encontrado que los problemas anteriores pueden solucionarse utilizando las partículas celulares obtenidas tras solubilizar la masa celular que no es PHA para suministrar adicionalmente los microorganismos que producen PHA. La reutilización de las partículas celulares anteriores como nutrientes aumenta notablemente los rendimientos de crecimiento celular y síntesis de PHA sobre sustratos carbonosos tales como glucosa, fructosa y

sacarosa, puesto que pueden asimilarse fácilmente por las células microbianas.

Por tanto, según un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir materiales poliméricos biodegradables incluyendo polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de una fuente de carbono orgánico, que comprende:

(a) cultivar células microbianas que producen PHA en una disolución de medio que contiene una fuente de carbono orgánico para formar PHA que se acumulan en las células como cuerpos de inclusión;

(b) recoger las células del medio gastado y solubilizar la masa celular que no es PHA para obtener un sólido de 65 PHA y una disolución de partículas celulares;

(c) separar el sólido de PHA de la disolución de partículas celulares;

(d) suministrar la disolución de partículas celulares a la etapa de cultivo (a) .

Descripción detallada de la invención.

Con “fuente de carbono orgánico” quiere decirse cualquier compuesto orgánico o mezclas de los mismos que pueden metabolizarse por células microbianas que producen PHA, tales como glucosa, fructosa, sacarosa o hidratos de carbono similares o cualquier mezcla orgánica de hidratos de carbono tales como pulpa de remolacha azucarera,

melaza de remolacha azucarera, melaza de caña de azúcar. La disolución de medio, además de la fuente de carbono orgánico, puede contener factores de crecimiento orgánicos adicionales, N, P y/u otros minerales tales como nutrientes para el crecimiento celular.

Según una realización preferida, la etapa de solubilización (b) se lleva a cabo: 15 (b1) solubilizando la masa celular que no es PHA en una disolución ácida para obtener una primera suspensión de un sólido de PHA en una disolución ácida de partículas celulares;

(b2) ajustando el pH de la primera suspensión a un valor de 7 a 11 para obtener una segunda suspensión del 20 sólido de PHA en una disolución básica de partículas celulares.

Según la realización preferida anterior, las células que contienen gránulos de PHA se tratan en primer lugar en una disolución ácida que libera una parte sustancial de las proteínas (partículas celulares ácidas) . Al mismo tiempo, los gránulos de PHA se cristalizan parcialmente a partir de la estructura lábil original, lo que hace que los poliésteres sean duros y resistentes a la digestión química. El tratamiento ácido puede llevarse a cabo añadiendo una disolución acuosa de un ácido fuerte, tal como ácido sulfúrico. Preferiblemente, la disolución acuosa de un ácido fuerte se añade a la masa celular que no es PHA en una cantidad como para lograr una concentración de iones de hidrógeno (H+) comprendida entre 0, 01 y 0, 5 moles/l. La etapa de solubilización (b1) se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura comprendida entre 80º y 130ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 0, 5 y 5 horas.

Tras la separación de la disolución ácida, las células con gránulos de PHA se tratan adicionalmente en una disolución básica para disolver el resto de la masa celular que no es PHA. Preferiblemente, la disolución básica es una disolución acuosa de al menos una base fuerte, tal como hidróxido de sodio o hidróxido de potasio.

El tratamiento alcalino puede ayudarse añadiendo al menos un tensioactivo, preferiblemente al menos un tensioactivo iónico, preferiblemente un sulfato de alquilo C6-C18, tal como dodecilsulfato de sodio (SDS) . El al menos un tensioactivo promueve la alteración celular y la descomposición de la membrana. El al menos un tensioactivo se añade preferiblemente en una cantidad comprendida entre 2 y 10 g/l, preferentemente entre 4 y 7 g/l.

El tratamiento de dos etapas anterior digiere y disuelve la mayoría de la masa celular que no es PHA mientras que se pierde poco PHA. Igualmente importante, los tratamientos pueden convertir las partículas celulares en formas apropiadas que pueden asimilarse directamente por las células microbianas como nutrientes para el crecimiento y la formación de PHA.

Pueden generarse tres tipos de disoluciones de partículas celulares en la recuperación de PHA como desechos acuosos:

1. Disolución ácida de partículas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para producir materiales poliméricos biodegradables incluyendo polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de una fuente de carbono orgánico, que comprende: 5

(a) cultivar células microbianas que producen PHA en una disolución de medio que contiene una fuente de carbono orgánico para formar PHA que se acumulan en las células como cuerpos de inclusión;

(b) recoger las células a partir del medio gastado y solubilizar la masa celular que no es PHA para obtener un 10 sólido de PHA y una disolución de partículas celulares;

(c) separar el sólido de PHA de la disolución de partículas celulares;

(d) suministrar la disolución de partículas celulares a la etapa (a) de cultivo. 15

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) de solubilización se lleva a cabo:

(b1) solubilizando la masa celular que no es PHA en una disolución ácida para obtener una primera suspensión de un sólido de PHA en una disolución ácida de partículas celulares; 20 (b2) ajustando el pH de la primera suspensión a un valor comprendido entre 7 y 11 para obtener una segunda suspensión del sólido de PHA en una disolución básica de partículas celulares.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que se lleva a cabo una etapa de separación (c1) en la primera 25 suspensión y la disolución ácida de partículas celulares resultante se suministra según la etapa (d) .

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que se lleva a cabo una etapa de separación (c2) en la segunda suspensión y la disolución básica de partículas celulares resultante se suministra según la etapa (d) .

5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que se lleva a cabo una etapa de separación (c3) en la segunda suspensión y la disolución ácido-base de partículas celulares resultante se suministra según la etapa (d) .

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad total de partículas celulares suministrada a la etapa de cultivo (a) está comprendida entre el 5 y el 50% en peso con respecto a la 35 cantidad del sustrato de carbono equivalente a glucosa.

7. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la cantidad de la disolución ácida de partículas celulares (ACDS) suministrada a la etapa (b) está comprendida entre el 5 y el 20% en peso con respecto al peso del sustrato de carbono equivalente a glucosa.

8. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la etapa de ajuste (b2) comprende añadir al menos un tensioactivo a la primera suspensión.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el al menos un tensioactivo es un tensioactivo iónico. 45

10. Procedimiento según la reivindicación 8 o 9, en el que el al menos un tensioactivo se añade en una cantidad comprendida entre 2 y 10 g/l.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones desde 2 hasta 10, en el que la etapa de solubilización 50 (b1) comprende añadir una disolución acuosa de un ácido fuerte a la masa celular que no es PHA.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que se añade la disolución acuosa de un ácido fuerte a la masa celular que no es PHA en una cantidad suficiente para lograr una concentración de iones de hidrógeno (H+) comprendida entre 0, 01 y 0, 5 moles/l.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones desde 2 hasta 12, en el que la etapa de solubilización (b1) se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 80º y 130ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre 0, 5 y 5 horas.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en el que la etapa de ajuste (b2) comprende añadir una disolución acuosa de al menos una base fuerte a la primera suspensión.