Uso de perfiles de localización subcelular como indicadores de prognóstico o predictivos.

Un método para determinar el estado de prognóstico de un tumor que expresa un receptor del factor delcrecimiento epidérmico (EGFR),

que comprende:

a) teñir una sección de tejido del tumor con:

(i) un reactivo para detectar EGFR,

(ii) un segundo reactivo para detectar una molécula efectora, siendo la molécula efectora un miembro de la vía detransducción de señales relacionada con EGFR,

(iii) un tercer reactivo para detectar el núcleo;

b) utilizando un microscopio, obtener una imagen digital de alta resolución de:

(i) el EGFR teñido;

(ii) la molécula efectora teñida; y

(iii) el núcleo teñido;

c) analizar la imagen digital para cuantificar una cantidad de:

(i) EGFR presente en la sección de tejido;

(ii) molécula efectora presente en el núcleo; y

(iii) molécula efectora presente en el citoplasma;

d) determinar una proporción efectora de la cantidad de molécula efectora dentro del núcleo a la cantidad demolécula efectora presente en el citoplasma;

en el que (i) un tumor con un nivel elevado de EGFR y una proporción efectora menor que el control indica una malaprognosis; (ii) un tumor con un nivel elevado de EGFR y una proporción efectora mayor que el control indica unaprognosis mejor; y (iii) un tumor con un nivel disminuido de EGFR y una proporción efectora menor que el controlindica una buena prognosis.

Uso de perfiles de localización subcelular como indicadores de prognóstico o predictivos.

La presente invención se refiere a un método para determinar el estado de un tumor que expresa un receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR) .

Antecedentes La señalización del receptor de tirosina quinasas y otras vías de señalización mediadas por receptores generalmente avanzan a través de una vía que incluye la unión al ligando, la activación del receptor, la fosforilación de proteínas intermedias de señalización en el citoplasma que amplifican o interconectan la señal, la translocación de un subconjunto de proteínas de señalización hacia el núcleo, seguido de la activación de la transcripción por la proteína translocada o por otros cofactores nucleares.

El EGFR (HER1) es un miembro de la familia HER de receptores de tirosina quinasas (RTK) . Cada RTK tiene un dominio de unión al ligando, una única región que abarca la membrana, y un dominio que contiene tirosina quinasa citoplásmico. En condiciones fisiológicas normales, la activación generalmente es controlada por la expresión temporal y espacial de los ligandos de RTK que incluye mecanismos tales como la homo-o heterodimerización de receptores, la activación de dominios de quinasas, la fosforilación, y los sitios de acoplamiento resultantes en dominios modificados que permiten la activación de vías de señalización corriente abajo implicadas en el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia, tales como Ras/MAPK, PI3K/Akt, PLCy, y STAT. Se sabe que la desregulación de la vía de señalización de EGFR/HER1 está implicada en el desarrollo y el crecimiento de muchos tumores, incluyendo de vejiga, cerebro, mama, colon, esófago, cabeza, riñón, pulmón, ovario, cuello, páncreas, próstata y estómago (véase, por ejemplo, Marmor, M.D., K.B. Skaria, y Y. Yarden, 2004, Signal transduction and oncogenesis by BrbB/HER receptors, Int .J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 58:903-913; Olayioye, M.A., R.M. Neve, H.A. Lane, y N.E. Hynes. 2000. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer. EMBO J.. 19:3159-3167; Riese, D.J., y D.F. Stem, 1998, Specificity within the EGF family/ErbB receptor family signaling network, Bioessays, 20:41-48; Schlessinger, J., 2004, Common and distinct elements in cellular signaling via EGF and FGF receptors, Science, 306:1506-1507; y Yarden, Y., y M.X. Sliwkowski, 2001, Untangling the ErbB signalling network, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2:127-137.)

El anticuerpo monoclonal Erbitux (cetuximab) , que se dirige a EGFR, tiene la aprobación de la FDA para el tratamiento del cáncer colorrectal. Además, Iressa y Tarceva, dos moléculas pequeñas que se dirigen a EGFR, tienen la aprobación de la FDA para el cáncer de pulmón no microcítico. DakoCytomation California, Inc., proporciona un compañero de diagnóstico aprobado por la FDA que puede detectar EGFR en biopsias de pacientes. Este ensayo puede ser útil, por ejemplo, para identificar pacientes que deberían responder favorablemente a compuestos terapéuticos dirigidos a EGFR. Sin embargo, la experiencia ha demostrado que los ensayos de diagnóstico de EGFR disponibles en la actualidad no se correlacionan bien con la respuesta del paciente a un tratamiento con compuestos terapéuticos dirigidos a EGFR.

Los documentos US2006/0094068 y US2007/0059785 presentan cada uno un ensayo para uno u otro marcador molecular (que puede incluir pERK o un ERK citoplásmico total comparado con ERK nuclear total) que puede ser útil para predecir si un individuo responderá, o para determinar si un paciente individual está respondiendo al tratamiento con un inhibidor de EGF o EGRF. El método requiere una biopsia antes y después del tratamiento procedente de un sujeto tratado con un inhibidor de EGF o EGFR.

Berclaz et al., Int. J. Oncology, 2001, 19:1155-1160 describen un análisis inmunohistoquímico de la expresión de las proteínas STAT1 y STAT3 nuclear y citoplásmica en carcinomas de mama primarios y lo correlacionan, entre otros, con la expresión de EGFR.

Suzuki et al., Modern Pathology, 2006, 19:986-998, describen un análisis de la amplificación del gen EGFR, la mutación del gen, la sobreexpresión/fosforilación de la proteína de EGFR, y la activación de sus moléculas corriente abajo en carcinomas de pulmón humanos.

Son necesarios métodos para determinar el estado de activación de una vía de transducción de señales con una referencia específica al receptor de interés, que probablemente requiera determinar dentro del mismo ensayo los niveles de expresión del receptor y de la molécula efectora de la vía, para lograr unos niveles de precisión adecuados.

También son necesarios métodos para determinar el estado de activación de una vía de transducción de señales asociada a un receptor, que evalúen más de una vía posible dentro del mismo ensayo.

También es necesario un ensayo que no requiera una biopsia tras el tratamiento. La labilidad de las proteínas fosforiladas, incluso durante cortos tiempos isquímicos entre la excisión del tejido y la fijación (o congelación) del tejido, puede limitar la utilidad clínica de un ensayo basado estrictamente en la detección de las proteínas fosforiladas. Por tanto, también es necesario diseñar estrategias alternativas para determinar el estado de activación de una vía de transducción de señales que no se basen en la detección precisa de moléculas efectoras fosforiladas, en especial para las moléculas que resultan inestables en la práctica clínica habitual o cuando no estén disponibles reactivos de detección específicos adecuados.

También es necesario un método que proporcione una información de prognóstico basada en la expresión del receptor y en el estado de activación de una vía o vías de transducción de señales.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un método para determinar el estado de prognóstico de un tumor que expresa un receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR) , que comprende:

a) teñir una sección de tejido del tumor con:

(i) un reactivo para detectar EGFR,

(ii) un segundo reactivo para detectar una molécula efectora, siendo la molécula efectora un miembro de la vía de transducción de señales relacionada con EGFR,

(iii) un tercer reactivo para detectar el núcleo;

b) utilizando un microscopio, obtener una imagen digital de alta resolución de:

(i) el EGFR teñido;

(ii) la molécula efectora teñida; y

(iii) el núcleo teñido;

c) analizar la imagen digital para cuantificar una cantidad de:

(i) EGFR presente en la sección de tejido;

(ii) molécula efectora presente en el núcleo; y

(iii) molécula efectora presente en el citoplasma;

d) determinar una proporción efectora de la cantidad de molécula efectora dentro del núcleo a la cantidad de molécula efectora presente en el citoplasma;

en el que (i) un tumor con un nivel elevado de EGFR y una proporción efectora menor que el control indica una mala prognosis; (ii) un tumor con un nivel elevado de EGFR y una proporción efectora mayor que el control indica una prognosis mejor; y (iii) un tumor con un nivel disminuido de EGFR y una proporción efectora menor que el control indica una buena prognosis.

La tinción en la etapa a) puede realizarse mediante un método inmunohistoquímico. El microscopio puede ser un microscopio óptico. En el método de la presente invención, la molécula efectora puede seleccionarse de Grb2, Ras, ERK1, ERK2, RAF1, MEK1, MEK2, AKT, pAKT, GSK3, pGSK3, mTOR, 70s6k, eIF4B, 4E-BPI, eIF2B, NFkB, CREB, JAK, y STAT. En una realización, la molécula efectora se selecciona del grupo que consist en Akt1, Erk y Stat3. La proporción efectora de Akt1, ERK, y STAT3 puede cuantificarse y pueden promediarse las proporciones para obtener un cociente de señalización. En la presente invención, el segundo reactivo puede utilizarse para determinar la cantidad de expresión total de una molécula efectora o la cantidad de expresión de una molécula efectora fosforilada. La molécula efectora puede ser un efector final.

El análisis de tumores para determinar el nivel de expresión de EGFR y la proporción de la cantidad de al menos una molécula efectora corriente abajo de EGFR en el núcleo con relación al citoplasma proporciona una indicación del nivel de activación de una vía de señalización de EGFR en un tumor concreto. Esta importante información puede ser útil, por ejemplo, para: (a) la clasificación de prognóstico de pacientes; (b) la predicción de la respuesta a un fármaco; (c) la selección de pacientes para terapias bioespecíficas (tales... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar el estado de prognóstico de un tumor que expresa un receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGFR) , que comprende:

a) teñir una sección de tejido del tumor con:

(i) un reactivo para detectar EGFR,

(ii) un segundo reactivo para detectar una molécula efectora, siendo la molécula efectora un miembro de la vía de transducción de señales relacionada con EGFR,

(iii) un tercer reactivo para detectar el núcleo; b) utilizando un microscopio, obtener una imagen digital de alta resolución de:

(i) el EGFR teñido;

(ii) la molécula efectora teñida; y

(iii) el núcleo teñido; c) analizar la imagen digital para cuantificar una cantidad de:

(i) EGFR presente en la sección de tejido;

(ii) molécula efectora presente en el núcleo; y

(iii) molécula efectora presente en el citoplasma;

d) determinar una proporción efectora de la cantidad de molécula efectora dentro del núcleo a la cantidad de molécula efectora presente en el citoplasma;

en el que (i) un tumor con un nivel elevado de EGFR y una proporción efectora menor que el control indica una mala prognosis; (ii) un tumor con un nivel elevado de EGFR y una proporción efectora mayor que el control indica una prognosis mejor; y (iii) un tumor con un nivel disminuido de EGFR y una proporción efectora menor que el control indica una buena prognosis.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la tinción en la etapa a) es mediante un método inmunohistoquímico.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el microscopio es un microscopio óptico.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula efectora se selecciona de Grb2, Ras, ERK1, ERK2, RAF1, MEK1, MEK2, AKT, pAKT, GSK3, pGSK3, mTOR, 70s6k, eIF4B.

4. BPI, eIF2B, NFkB, CREB, JAK, y STAT.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la molécula efectora se selecciona del grupo que consiste en Akt1, Erk, y Stat3.

6. El método de la reivindicación 5, en el que se cuantifica la proporción efectora de Akt1, ETK, y STAT3, y se promedian las proporciones para obtener un cociente de señalización.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el segundo reactivo se utiliza para determinar la cantidad de expresión total de una molécula efectora o la cantidad de expresión de una molécula efectora fosforilada.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula efectora es un efector final.