Uso de microvesículas (MVS), para preparar un medicamento que tiene actividad de adyuvante en el trasplante de células endoteliales, particularmente en el tratamiento de la diabetes mediante el trasplante de islotes pancreáticos,y método relacionado.

Una microvesícula (MV) derivada de una célula progenitora endotelial (CPE) para utilizar como un medicamento,

que tiene actividad adyuvante en el tratamiento de la diabetes tipo I y II, mediante el trasplante de islote pancreático.

Uso de microvesículas (MVS) , para preparar un medicamento que tiene actividad de adyuvante en el trasplante de células endoteliales, particularmente en el tratamiento de la diabetes mediante el trasplante de islotes pancreáticos, y método relacionado.

La presente invención en general cae dentro del campo del trasplante de islote pancreáticos-células endoteliales, y en particular se relaciona con el tratamiento terapéutico de la diabetes tipo I y II mediante el trasplante de islote pancreático.

En los últimos años, el trasplante de islotes se ha convertido en una creciente opción terapéutica para el tratamiento de la diabetes tipo I y tipo II, después de la introducción de un régimen inmunosupresor libre de glucocorticoides basado en la rapamicina y la mejora de técnicas de aislamiento (1-3) . Sin embargo, un gran porcentaje de islotes trasplantados sigue sin injertar en el hígado después de la infusión en la vena porta y, en consecuencia, los páncreas de múltiples donantes son necesarios para garantizar una suficiente masa de islotes, para lograr un beneficio metabólico.

Con el fin de aumentar el éxito del procedimiento, sería necesario identificar cuales factores son capaces de mejorar la funcionalidad y la supervivencia de los islotes trasplantados.

Se conoce que las células progenitoras endoteliales (CPEs) son reclutadas en el páncreas en respuesta a la lesión del islote y también se

que la neovascularización del páncreas mediada por CPE puede facilitar la recuperación de las células lesionadas, mejorando la función del aloinjerto del islote (4, 5) . Sin embargo, el uso de CPEs en trasplante celular no es aconsejable dado el potencial riesgo tumorigénico de las células madre.

Las referencias Brissova Marcela et al.: "Intraislet endothelial cells contribute to revascularization of transplanted pancreatic islets", Diabetes, May 2004, vol. 53, No. 5, pages 1318-1325 y Mathews Virkram et al. "Recruitment of bone marrow-derived endothelial cells to sites of pancreatic beta-cell injur y ", Diabetes, Januar y 2004, vol. 53, No. 1, pages 91-98, revelan el uso de trasplante del islote pancreático en el tratamiento de la diabetes tipo I, y revelan que un co-trasplante con células endoteliales exógenas o CPEs, puede promover el injerto del islote y la revascularización.

Actualmente, la presente invención ha encontrado que las microvesículas (MVs) derivadas de células del linaje de la célula endotelial, específicamente a partir de las células progenitoras endoteliales (CPEs) , representan una alternativa ventajosa sobre el conjunto de las células madre como un factor adyuvante en la terapia de la diabetes tipo I y tipo II, mediante el trasplante de islotes.

La expresión "microvesículas (MVs) derivadas de células del linaje de la célula endotelial" como se utiliza en este documento se refiere a una partícula membranosa, la cual al menos se deriva en parte del compartimento endosomal de una célula del linaje de la célula endotelial bajo fusión con la membrana celular exterior, específicamente a partir del compartimento endosomal de una CPE.

Las microvesículas derivadas de células del linaje de la célula endotelial, específicamente de las CPEs, por lo general son de forma esferoide y tienen un diámetro dentro del rango de 100 nm a 5 mm, generalmente más de aproximadamente 1 mm. Si la partícula no tiene forma esferoide, los valores mencionados anteriormente se refieren a la mayor dimensión de la partícula.

La expresión "células del linaje endotelial" se refiere a las células que se derivan de precursores hematopoyéticos comunes originados en la médula ósea, capaces de diferenciar en las células endoteliales funcionales maduras (6) .

Las células del linaje endotelial, específicamente CPEs, se aíslan convenientemente a partir de la sangre periférica mediante centrifugación de densidad y se siembran en placas sobre un medio de cultivo tal como EBM-2 (medio basal endotelial) , suplementado con factores de crecimiento endotelial (Deregibus M C et al., Blood. 1 Oct 2007; 110 (7) :2440-8. Pre-publicado en internet el 29 de Mayo de 2007) . A continuación, las microvesículas (MVs) se pueden obtener a partir de los sobrenadantes de las CPEs aisladas, mediante técnicas de ultracentrifugación como se revela en Deregibus, 2007 y en la sección experimental de la presente descripción.

Entonces, las MVs aisladas se pueden almacenar hasta su uso, mediante la congelación a muy baja temperatura, por lo general a -80°C, en una suspensión con uno o más agentes crioprotectores. Las sustancias crioprotectoras apropiadas son por ejemplo dimetilsulfóxido (DMSO) y glicerol. El uso de DMSO a una concentración de 10% del volumen de la suspensión celular garantiza una buena conservación de las células y un efecto tóxico limitado en los pacientes a los que se les repite la infusión. Otras sustancias que se pueden citar son los agentes crioprotectores extracelulares, es decir sustancias de alto peso molecular que actúan en la superficie celular formando una barrera bien cerrada que reduce la deshidratación intracelular. El almidón hidroxietílico, se puede citar como ejemplo.

Las MVs derivadas de CPE fueron analizadas por los presentes inventores tanto in vitro como in vivo en un modelo experimental de trasplante subcutáneo de islotes en ratones SCID. Los ratones SCID no son capaces de producir células T y B y en consecuencia no son capaces de luchar contra las infecciones y de rechazar el tejido trasplantado.

El trabajo experimental llevado a cabo por los presentes inventores, el cual se ilustra con más detalle en la sección experimental de la descripción, demostró que las MVs derivadas de CPE, cuando se administran a un receptor de trasplante de islote pancreático de célula endotelial, y particularmente a un receptor del trasplante del islote pancreático, actúan como un factor adyuvante del trasplante, ya que mejoran la supervivencia y la funcionalidad de células endoteliales trasplantadas. Más particularmente, los inventores observaron que las MVs son capaces de promover la angiogénesis y la formación de las estructuras similares a las capilares a partir de células endoteliales, así como la secreción de la insulina a partir de células de los islotes, así como la replicación, la resistencia a la apoptosis y la migración de células endoteliales. Lo más importante, el efecto adyuvante mencionado anteriormente de MVs no se inhibe completamente por la incubación con dosis terapéuticas de rapamicina, el inmunosupresor básico en trasplante del islote pancreático. Esto es más sorprendente dado que se conoce que la rapamicina ejerce un efecto dual sobre el endotelio del islote, con la inducción de un efecto inmunomodulador simultáneo a través de la expresión inhibida de los receptores involucrados en la activación y la adhesión de linfocitos, pero también la inhibición de la angiogénesis (7) .

Por lo tanto, una parte de la invención es el uso de microvesículas (MVs) derivadas de una célula progenitora endotelial (CPE) , para preparar un medicamento que tiene una actividad de adyuvante en el tratamiento de la diabetes tipo I o II, mediante el trasplante de islote pancreático.

Como será demostrado en la sección experimental, la actividad de adyuvante de las microvesículas consiste en la mejora de la supervivencia y la funcionalidad de los islotes pancreáticos trasplantados y las células endoteliales.

Adicionalmente, como se menciona anteriormente, la actividad de adyuvante de MVs no está abolida por la administración de dosis terapéuticas de rapamicina como un inmunosupresor. Por consiguiente, las MVs empleadas en la presente invención se utilizan como un agente adyuvante dentro del marco de trasplante del islote pancreático opcionalmente en combinación con la rapamicina. La expresión "en combinación con" no significa que MVs y la rapamicina se deban mezclar necesariamente juntas, ni que necesariamente se deban administrar de forma simultánea. La expresión "en combinación con" simplemente significa que las MVs se administran al receptor del trasplante del islote, preferiblemente junto con los islotes en sí y generalmente mediante infusión intravenosa, dentro del marco de un procedimiento del trasplante del islote pancreático incluyendo al menos una etapa en la cual el receptor se somete a inmunosupresión basada en la rapamicina antes y/o durante y/o después del trasplante. En dicho contexto, la rapamicina generalmente se utiliza para alcanzar niveles plasmáticos por medio de niveles de 1215 ng/ml en la primera semana después del trasplante de islotes humanos (1) .

Como se menciona anteriormente, las MVs se pueden administrar mediante infusión intravenosa... [Seguir leyendo]

1. Una microvesícula (MV) derivada de una célula progenitora endotelial (CPE) para utilizar como un medicamento, que tiene actividad adyuvante en el tratamiento de la diabetes tipo I y II, mediante el trasplante de islote pancreático.

2. Las microvesículas (MVs) para utilizar de acuerdo con la reivindicación 1, que están en la forma de un 5 medicamento apropiado para la administración mediante infusión intravenosa.

3. La microvesícula (MV) para utilizar de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el medicamento es apropiado para administrar una dosis de microvesícula comprendida entre 0.1 y 10 microgramos/Kg de peso del receptor.

4. La microvesícula (MV) para utilizar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el

procedimiento del trasplante del islote pancreático incluye al menos una etapa en la cual el receptor se somete a 10 inmunosupresión basada en la rapamicina antes y/o durante y/o después del trasplante.

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