Tira de prueba para líquidos y procedimiento.

Una tira de prueba (1) para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende unsustrato (10) con al menos un canal (11) sobre el mismo,

en que el canal (11) tiene una primera región (111), unasegunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas sucesivamente y en que la primera región (111) se usapara la introducción de una muestra líquida en la misma, en que la tira de prueba (1) se caracteriza porque: seproporciona una capa de fibra (1110) en el fondo de la primera región (1111); se proporciona una capa denitrocelulosa (1120, 1130) en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113); en que la tira deprueba (1) comprende además: un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en lacapa de fibra (1110) para el reconocimiento de un analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizadoen la primera o en la segunda región (111, 112); una peroxidasa (1113); un segundo anticuerpo (1121) inmovilizadoen la segunda región (112), en la capa de nitrocelulosa, para el reconocimiento del analito (1101) en la muestralíquida, en que el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocerdiferentes epítopos del analito (1101) en la muestra líquida; y un sustrato óptico (1131) y un reactivo de sustrato(1132) localizados en la tercera región (113) y con el reactivo de sustrato integrado en la capa de nitrocelulosa(1130), en que el reactivo de sustrato (1132) comprende una sacárido-oxidasa (1133); en que el primer anticuerpo(1111) y la peroxidasa (1113) se localizan en la primera región (111) y pueden conjugarse entre sí o en que, cuandola peroxidasa (1113) se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112), el primer anticuerpo (1111) puedeconjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) puede conjugarse con una moléculaseleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo debiotina y avidina.

Tira de prueba para líquidos y procedimiento.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a una tira de prueba para líquidos y, más especialmente, a una tira de 10 prueba para líquidos para ensayos cuantitativos de líquidos biológicos.

2. Descripción de la técnica relacionada [0002] Los ensayos analíticos cuantitativos tradicionales utilizan una capacidad única que tienen las moléculas inmunológicas, las cuales pueden reconocer y también unirse a las moléculas biológicas de manera específica. Por ejemplo, el enzimoinmunoanálisis de adsorción tradicional (ELISA) , que se realiza típicamente en una placa de 96 pocillos, se caracteriza porque determina la concentración de un analito (es decir, un antígeno) por la intensidad de una señal detectada que resulta de la reacción entre el analito, las moléculas inmunológicas correspondientes, las enzimas y los reactivos correspondientes. Sin embargo, habitualmente los usuarios necesitan llevar a cabo un tedioso lavado en cada etapa del ensayo para eliminar las moléculas sin unir y las moléculas de unión inespecífica, para evitar que el ensayo falle o que se produzcan falsos positivos.

Con el progreso de la tecnología, en la actualidad los ensayos analíticos inmunológicos se llevan a cabo con tiras de prueba para líquidos que cuentan con canales microfluídicos para simplificar o incluso omitir las 25 complicadas y repetidas tareas de lavado requeridas tradicionalmente después de cada etapa de reacción del ensayo. Sin embargo, la tira de prueba para líquidos conocida, en la que es necesario añadir manualmente a dicha tira de prueba para líquidos los reactivos o los sustratos requeridos para las reacciones, es desventajosa para los usuarios. Los reactivos o los sustratos requeridos para las tiras convencionales tienden a degradarse a temperatura ambiente o a la luz después de un almacenamiento prolongado, lo que resulta en errores en el ensayo. Por

consiguiente, tales reactivos necesitan almacenarse en condiciones específicas, como refrigeración o a prueba de luz. En consecuencia, sin embargo, las tiras de prueba para líquidos convencionales son desventajosas en cuanto a uso y almacenamiento.

Además, las tiras de prueba para líquidos convencionales con canales o con canales microfluídicos presentan otros problemas. Aunque un canal o canal microfluídico tal está rodeado de un material no absorbente y normalmente la viscosidad de la muestra líquida para analizar es alta porque la muestra se compone principalmente de proteínas o carbohidratos, parte de la muestra líquida tiende a adherirse a la superficie del canal y no participará en la reacción. Un escenario tal, si se produce, no solamente causa desventajosamente la pérdida de muestra líquida para analizar, sino que también tiene un efecto adverso en la precisión de los ensayos cuantitativos.

Adicionalmente, la tira de prueba para líquidos convencional puede facilitar el flujo de la muestra líquida por los canales microfluídicos, de modo que la muestra líquida sea suministrada al área de reacción por la fuerza capilar ejercida por las estructuras de tales canales. Otra estrategia alternativa para suministrar la muestra líquida supone la aplicación de una fuerza impulsora, como presurización, en el momento en que la muestra líquida 45 se introduce en el canal, de modo que la muestra líquida sea impulsada al área de reacción a través del canal. Sin embargo, las dos estrategias mencionadas anteriormente tienden a causar la producción de burbujas de aire después de haber introducido la muestra líquida en el canal. Estas burbujas, ya sean grandes o pequeñas, bloquearán el canal y darán lugar a resultados imprecisos en el análisis.

El documento US 6.218.134 B1 describe un dispositivo de prueba y un procedimiento para uso del mismo. El dispositivo de prueba incluye una matriz, moléculas de anticuerpo inmovilizadas en la matriz y un generador de una sustancia señal, dispuesto en la matriz de manera móvil. Cuando se suministra una sustancia para su análisis, dicha sustancia se acopla con las moléculas de anticuerpo y los generadores de la sustancia señal se mueven hacia dicha sustancia para acoplarse con ella. Una sustancia relacionada con la generación de una 55 sustancia señal alcanza a los generadores de la sustancia señal con el fin de formar una sustancia señal que, en función de la distancia a un electrodo, se mueve hacia dicho electrodo hasta alcanzarlo y proporciona una señal proporcional a la cantidad de la sustancia de ensayo. Sin embargo, este dispositivo de prueba tiene la desventaja de que se requiere mucho tiempo hasta que el generador de la sustancia señal alcanza la sustancia de ensayo y existe el riesgo de que también alcance el electrodo una sustancia señal formada por la reacción de la sustancia relacionada con la generación de la sustancia señal con un generador de sustancia señal acoplado a la sustancia de ensayo, lo que conduciría a un resultado de detección erróneo. Por lo tanto, a partir de este estado de la técnica, el objetivo de la presente invención es proporcionar una tira de prueba y un procedimiento para uso de la misma que permitan una detección acelerada y al mismo tiempo garanticen un resultado de detección fiable.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

El objetivo mencionado anteriormente se consigue mediante la tira de prueba de acuerdo con la reivindicación 1 y el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5. Algunas mejoras ventajosas de la invención se describen en las reivindicaciones subordinadas correspondientes.

Para solucionar las deficiencias mencionadas anteriormente, la presente invención desvela una tira de prueba para líquidos para el ensayo cuantitativo de muestras líquidas. La tira de prueba para líquidos comprende un sustrato con al menos un canal en el mismo. El canal tiene una primera región para recibir una muestra líquida, una 15 segunda región y una tercera región. Estas regiones están dispuestas sucesivamente. La primera región se usa para la introducción de la muestra líquida en la misma. Además, la tira de prueba para líquidos tiene una capa de fibra dispuesta en el fondo de la primera región y una capa de nitrocelulosa dispuesta en el fondo de cada una de las regiones segunda y tercera. Adicionalmente, el canal contiene un primer anticuerpo, un sacárido, una peroxidasa, un segundo anticuerpo, un sustrato óptico y un reactivo de sustrato. El primer anticuerpo se localiza en la primera 20 región y está integrado en la capa de fibra para el reconocimiento de un analito en la muestra líquida. El sacárido y la peroxidasa pueden localizarse en la primera o en la segunda región. El segundo anticuerpo está inmovilizado en la segunda región, en la capa de nitrocelulosa, para el reconocimiento del mismo analito que el primer anticuerpo. Sin embargo, el segundo anticuerpo y el primer anticuerpo están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito. El sustrato óptico y el reactivo de sustrato, que comprende una sacárido-oxidasa, se localizan en la 25 tercera región y el reactivo del sustrato está integrado en la capa de nitrocelulosa. Al introducir la muestra líquida en el canal, el primer anticuerpo, el sacárido y la peroxidasa fluirán junto con la muestra líquida. El primer anticuerpo y la peroxidasa, cuando esta se localiza en la primera región, pueden conjugarse entre sí. Alternativamente, el primer anticuerpo puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa puede conjugarse con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina. Una cantidad parcial de la peroxidasa, el primer anticuerpo y el analito se unirán conjuntamente al segundo anticuerpo y, de este modo, quedan retenidos en la segunda región. La peroxidasa sin unir fluirá a la tercera región junto con la muestra líquida. El sacárido será oxidado por la sacárido-oxidasa para producir peróxido de hidrógeno (H2O2) . Después, el sustrato óptico y el peróxido de hidrógeno producido serán catalizados por la peroxidasa en la tercera región para producir una señal óptica.

Por lo tanto, un objetivo primordial de la presente invención es proporcionar una tira de prueba para líquidos que contenga en su mayor parte los reactivos y materiales requeridos para la reacción, sin etapas complicadas.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar una tira de prueba para líquidos en la que, en su mayor parte, los reactivos y materiales requeridos para la reacción contenidos en la misma estén en forma seca, de modo que la tira de prueba para líquidos pueda almacenarse durante un periodo relativamente prolongado... [Seguir leyendo]

1. Una tira de prueba (1) para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende un sustrato (10) con al menos un canal (11) sobre el mismo, en que el canal (11) tiene una primera región (111) , una 5 segunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas sucesivamente y en que la primera región (111) se usa para la introducción de una muestra líquida en la misma, en que la tira de prueba (1) se caracteriza porque: se proporciona una capa de fibra (1110) en el fondo de la primera región (1111) ; se proporciona una capa de nitrocelulosa (1120, 1130) en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113) ; en que la tira de prueba (1) comprende además: un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en la 10 capa de fibra (1110) para el reconocimiento de un analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizado en la primera o en la segunda región (111, 112) ; una peroxidasa (1113) ; un segundo anticuerpo (1121) inmovilizado en la segunda región (112) , en la capa de nitrocelulosa, para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida, en que el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito (1101) en la muestra líquida; y un sustrato óptico (1131) y un reactivo de sustrato 15 (1132) localizados en la tercera región (113) y con el reactivo de sustrato integrado en la capa de nitrocelulosa (1130) , en que el reactivo de sustrato (1132) comprende una sacárido-oxidasa (1133) ; en que el primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) se localizan en la primera región (111) y pueden conjugarse entre sí o en que, cuando la peroxidasa (1113) se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112) , el primer anticuerpo (1111) puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) puede conjugarse con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina.

2. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que el sustrato óptico (1131) es 5-amino-2, 3-dihidro-1, 4

ftalazinadiona. 25

3. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que la capa de nitrocelulosa (1120, 1130) comprende una conformación de matriz hueca y se prepara por vaciado de una disolución de nitrocelulosa en el fondo de la segunda y la tercera región (112, 113) , seguido de un proceso de secado.

4. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que cada una de las regiones segunda (112) y tercera (113) tiene una anchura de al menos 0, 3 mm.

5. Un procedimiento para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende las etapas de:

proporcionar (21) una muestra líquida que contiene un analito (1101) ;

proporcionar (22) una tira de prueba (1) que incluye un sustrato (10) con al menos un canal (11) que tiene una primera región (111) , una segunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas sucesivamente, en que la 40 primera región (111) se usa para la introducción de la muestra líquida en la misma; una capa de fibra (110) en el fondo de la primera región (111) ; y una capa de nitrocelulosa (1120, 1130) en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113) ; en que la tira de prueba (1) comprende además: un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en la capa de fibra (1110) para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizado en la primera o en la segunda región (111, 112) ; una peroxidasa 45 (1113) ; un segundo anticuerpo (1121) inmovilizado en la segunda región (112) , en la capa de nitrocelulosa (1120) , para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida, en que el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito (1101) ; y un sustrato óptico (1131) y un reactivo de sustrato (1132) localizados en la tercera región (113) y con el reactivo de sustrato integrado en la capa de nitrocelulosa (1130) y en que el reactivo de sustrato (1132) comprende una sacárido-oxidasa (1133) ;

en que el primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) se localizan en la primera región (111) y se conjugan entre sí o en que, cuando la peroxidasa (1113) se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112) , el primer anticuerpo (1111) se conjuga además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) se conjuga con una avidina, en que la avidina se selecciona del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina;

introducir (23) la muestra líquida en la primera región (111) del canal (11) para permitir que el primer anticuerpo (1111) , el sacárido (1112) y la peroxidasa (1113) , si la peroxidasa está localizada en la primera región (111) , fluyan conjuntamente con la muestra líquida; permitir (24) que el analito (1101) y una parte del primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) se unan al segundo anticuerpo (1121) , de modo que queden retenidos en la segunda región (112) ; permitir que el sacárido (1112) y la otra parte del primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) fluyan a la tercera región (113) junto con la muestra líquida, de modo que el sacárido (1112) sea catalizado por la sacárido-oxidasa (1133) para producir

peróxido de hidrógeno; permitir que el sustrato óptico (1131) sea catalizado por la peroxidasa (1113) que llega a la tercera región (113) y reaccione con el peróxido de hidrógeno para generar una señal óptica; y

detectar (25) la señal óptica generada.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en que el sustrato óptico (1131) es 5-amino-2, 3-dihidro-1, 4ftalazinadiona.

7. El procedimiento de detección de la reivindicación 5, en que la capa de nitrocelulosa (1120, 1130)

comprende una conformación de matriz hueca y se prepara por vaciado de una disolución de nitrocelulosa en el 15 fondo de la segunda y la tercera región (112, 113) , seguido de un proceso de secado.

8. El procedimiento de detección de la reivindicación 5, en que cada una de las regiones segunda (112) y tercera (113) tiene una anchura de al menos 0, 3 mm.