Tira de prueba para líquidos y procedimiento para la misma.

Una tira de prueba (1) para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende una capade electrodos (19) y un sustrato (1) con al menos un canal (11) sobre el mismo,

en que el canal (11) incluye unaprimera región (111), una segunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas sucesivamente y en que laprimera región (111) se usa para la introducción de una muestra líquida en la misma y en que la tira de prueba (1)tiene una capa de fibra (1110) dispuesta en el fondo de la primera región (111) y una capa de nitrocelulosa (1120,1130) dispuesta en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113), en que la tira de prueba (1)comprende además un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en la capa de fibra(1110) para el reconocimiento de un analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizado en la primerao en la segunda región (111, 112); una peroxidasa (1113); un segundo anticuerpo (1121) inmovilizado en la segundaregión (112), en la capa de nitrocelulosa (1120), para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida, enque el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocer diferentesepítopos del analito (1101) en la muestra líquida; y un reactivo de sustrato (1132) localizado en la tercera región(113), integrado en la capa de nitrocelulosa (1130) y que comprende una sacárido-oxidasa (1133), en que el primeranticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113), cuando esta se localiza en la primera región (111), pueden conjugarseentre sí o en que, cuando la peroxidasa se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112), el primeranticuerpo (1111) puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) puede conjugarse conuna molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma uncomplejo de biotina y avidina.

Tira de prueba para líquidos y procedimiento para la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Campo técnico [0001] La presente invención se refiere a tiras de prueba para líquidos y, más especialmente, a una tira de 10 prueba para líquidos para el ensayo cuantitativo de líquidos biológicos.

2. Descripción de la técnica relacionada [0002] Los ensayos bioquímicos cuantitativos tradicionales utilizan habitualmente una enzima específica para reaccionar con un analito específico y detectar entonces el cambio en las propiedades químicas o eléctricas de los reactantes o los productos de la reacción. Por ejemplo, es convencional determinar la concentración de glucosa en un líquido biológico mediante detección de la variación de la tensión o de la corriente eléctrica causada por el peróxido de hidrógeno producido en la reacción de la glucosa en el líquido biológico con la glucosa-oxidasa inmovilizada sobre electrodos de oxígeno disuelto. Después se calcula la concentración del peróxido de hidrógeno, a lo que sigue la determinación de la concentración de glucosa en el líquido biológico, ya que la concentración de la glucosa-oxidasa es conocida. Dado que se requiere una cantidad relativamente pequeña de peróxido de hidrógeno para causar cambios en la tensión o la corriente eléctrica, los ensayos electroquímicos, como el ensayo descrito anteriormente, son ventajosos porque el volumen necesario de líquido biológico es asimismo relativamente pequeño y la detección es rápida. Sin embargo, un ensayo tal requiere enzimas específicas para producir peróxido para su detección y, por lo tanto, solo es aplicable al análisis cuantitativo de moléculas pequeñas como glucosa, colesterol, urea, creatinina, etc.

Otra estrategia conocida es utilizar una capacidad única que tienen las moléculas inmunológicas, ya que pueden reconocer y también unirse a las moléculas biológicas de manera específica. Por ejemplo, el 30 enzimoinmunoanálisis de adsorción tradicional (ELISA) , que se realiza típicamente en una placa de 96 pocillos, se caracteriza porque determina la concentración de un analito (es decir, un antígeno) por la intensidad de una señal detectada que resulta de la reacción entre el analito, las moléculas inmunológicas correspondientes, las enzimas y los reactivos correspondientes. Sin embargo, habitualmente los usuarios necesitan llevar a cabo un tedioso lavado en cada etapa del ensayo para eliminar las moléculas sin unir y las moléculas de unión inespecífica, para evitar que el ensayo falle o que se produzcan falsos positivos.

Con el progreso de la tecnología, en la actualidad los ensayos analíticos inmunológicos se llevan a cabo con tiras de prueba para líquidos que cuentan con canales microfluídicos para simplificar o incluso omitir las complicadas y repetidas tareas de lavado requeridas tradicionalmente después de cada etapa de reacción del 40 ensayo. Sin embargo, en las tiras de prueba para líquidos conocidas es desventajosa la necesidad de añadir manualmente a la tira de prueba para líquidos los reactivos o los sustratos requeridos para las reacciones. Los reactivos o los sustratos requeridos para las tiras convencionales tienden a degradarse a temperatura ambiente o a la luz después de un almacenamiento prolongado, lo que resulta en errores en el ensayo. Por consiguiente, tales reactivos necesitan almacenarse en condiciones específicas, como refrigeración o a prueba de luz. En 45 consecuencia, sin embargo, las tiras de prueba para líquidos convencionales son desventajosas en cuanto a uso y almacenamiento.

Además, las tiras de prueba para líquidos convencionales con canales o con canales microfluídicos presentan otros problemas. Aunque un canal o canal microfluídico tal está rodeado de un material no absorbente y

normalmente la viscosidad de la muestra líquida para analizar es alta porque la muestra se compone principalmente de proteínas o carbohidratos, siempre hay una parte de la muestra líquida que tiende a adherirse a la superficie del canal y no participa en la reacción. Un escenario tal, si se produce, no solamente causa desventajosamente la pérdida de muestra líquida para analizar, sino que también tiene un efecto adverso en la precisión de los ensayos cuantitativos.

Adicionalmente, la tira de prueba para líquidos convencional puede facilitar el flujo de la muestra líquida por los canales microfluídicos, de modo que la muestra líquida sea suministrada al área de reacción por la fuerza capilar ejercida por las estructuras de tales canales.

Otra estrategia alternativa para suministrar la muestra líquida supone la aplicación de una fuerza impulsora, como presurización, en el momento en que la muestra líquida se introduce en el canal, de modo que la muestra líquida sea impulsada al área de reacción a través del canal. Sin embargo, las dos estrategias mencionadas anteriormente tienden a causar la producción de burbujas de aire después de haber introducido la muestra líquida en el canal. Estas burbujas, ya sean grandes o pequeñas, bloquearán el canal y darán lugar a resultados imprecisos en el análisis.

El documento US 6.218.134 B1 describe un dispositivo de prueba y un procedimiento para uso del mismo. El dispositivo de prueba incluye una matriz, moléculas de anticuerpo inmovilizadas en la matriz y un 10 generador de una sustancia señal, dispuesto en la matriz de manera móvil. Cuando se suministra una sustancia para su análisis, dicha sustancia se acopla con las moléculas de anticuerpo y los generadores de la sustancia señal se mueven hacia dicha sustancia para acoplarse con ella. Una sustancia relacionada con la generación de una sustancia señal alcanza a los generadores de la sustancia señal con el fin de formar una sustancia señal que, en función de la distancia a un electrodo, se mueve hacia dicho electrodo hasta alcanzarlo y proporciona una señal 15 proporcional a la cantidad de la sustancia de ensayo. Sin embargo, este dispositivo de prueba tiene la desventaja de que se requiere mucho tiempo hasta que el generador de la sustancia señal alcanza la sustancia de ensayo y existe el riesgo de que también alcance el electrodo una sustancia señal formada por la reacción de la sustancia relacionada con la generación de la sustancia señal con un generador de sustancia señal acoplado a la sustancia de ensayo, lo que conduciría a un resultado de detección erróneo. Por lo tanto, a partir de este estado de la técnica, el

objetivo es proporcionar una tira de prueba que permita una detección acelerada y al mismo tiempo garantice un resultado de detección fiable.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

El objetivo mencionado anteriormente se consigue mediante la tira de prueba de acuerdo con la reivindicación 1 y el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5. Algunas mejoras ventajosas se consiguen mediante las reivindicaciones subordinadas correspondientes.

Para solucionar las deficiencias mencionadas anteriormente, la presente invención desvela una tira de prueba para líquidos para el ensayo cuantitativo de muestras líquidas. La tira de prueba para líquidos comprende un sustrato con al menos un canal en el mismo. El canal tiene una primera región para recibir una muestra líquida, una segunda región y una tercera región. Estas regiones están dispuestas sucesivamente. La primera región se usa para la introducción de la muestra líquida en la misma. Además, la tira de prueba tiene una capa de fibra dispuesta en el fondo de la primera región y una capa de nitrocelulosa dispuesta en el fondo de cada una de las regiones segunda y

tercera. Adicionalmente, el canal contiene un primer anticuerpo, un sacárido, una peroxidasa, un segundo anticuerpo y un reactivo de sustrato. El primer anticuerpo se localiza en la primera región y está integrado en la capa de fibra para el reconocimiento de un analito en la muestra líquida. El sacárido y la peroxidasa se localizan en la primera o en la segunda región. El segundo anticuerpo está inmovilizado en la segunda región, en la capa de nitrocelulosa, para el reconocimiento del mismo analito que el primer anticuerpo. Sin embargo, el segundo anticuerpo y el primer

anticuerpo están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito. El reactivo de sustrato se localiza en la tercera región y está integrado en la capa de nitrocelulosa. El reactivo de sustrato comprende una sacárido-oxidasa. Al introducir la muestra líquida en el canal, el primer anticuerpo, el sacárido y la peroxidasa fluirán junto con la muestra líquida. El primer anticuerpo y la peroxidasa, cuando esta se localiza en la primera región, pueden conjugarse entre sí. Alternativamente, cuando la peroxidasa se localiza en la primera... [Seguir leyendo]

1. Una tira de prueba (1) para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende una capa de electrodos (19) y un sustrato (1) con al menos un canal (11) sobre el mismo, en que el canal (11) incluye una 5 primera región (111) , una segunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas sucesivamente y en que la primera región (111) se usa para la introducción de una muestra líquida en la misma y en que la tira de prueba (1) tiene una capa de fibra (1110) dispuesta en el fondo de la primera región (111) y una capa de nitrocelulosa (1120, 1130) dispuesta en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113) , en que la tira de prueba (1) comprende además un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en la capa de fibra (1110) para el reconocimiento de un analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizado en la primera o en la segunda región (111, 112) ; una peroxidasa (1113) ; un segundo anticuerpo (1121) inmovilizado en la segunda región (112) , en la capa de nitrocelulosa (1120) , para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida, en que el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito (1101) en la muestra líquida; y un reactivo de sustrato (1132) localizado en la tercera región 15 (113) , integrado en la capa de nitrocelulosa (1130) y que comprende una sacárido-oxidasa (1133) , en que el primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) , cuando esta se localiza en la primera región (111) , pueden conjugarse entre sí o en que, cuando la peroxidasa se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112) , el primer anticuerpo (1111) puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) puede conjugarse con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina.

2. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que la capa de nitrocelulosa (1120, 1130) comprende una conformación de matriz hueca y se prepara por vaciado de una disolución de nitrocelulosa en el fondo de la segunda y la tercera región (112, 113) , seguido de un proceso de secado.

3. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que cada una de las regiones segunda (112) y tercera (113) tiene una anchura de al menos a 0, 3 mm.

4. La tira de prueba (1) de la reivindicación 1, en que el canal (11) comprende además una cuarta región con una capa de nitrocelulosa dispuesta en el fondo de la misma para acomodar el exceso de muestra líquida, en que dicha nitrocelulosa comprende una matriz hueca.

5. Un procedimiento para el ensayo cuantitativo de un analito en un líquido que comprende las etapas de:

proporcionar (21) una muestra líquida que contiene una analito (1101) ;

proporcionar (22) una tira de prueba (1) que incluye una capa de electrodos (19) y un sustrato (10) con al menos un canal (11) que incluye una primera región (111) , una segunda región (112) y una tercera región (113) dispuestas 40 sucesivamente, en que la primera región (111) permite la introducción de una muestra líquida en la misma y en que la tira de prueba tiene una capa de fibra (1110) dispuesta en el fondo de la primera región (111) y una capa de nitrocelulosa (1120, 1130) dispuesta en el fondo de cada una de la regiones segunda y tercera (112, 113) ; en que la tira de prueba (1) comprende: un primer anticuerpo (1111) localizado en la primera región (111) e integrado en la capa de fibra (1110) para el reconocimiento de un analito (1101) en la muestra líquida; un sacárido (1112) localizado 45 en la primera o en la segunda región (111, 112) ; una peroxidasa (1113) ; un segundo anticuerpo (1121) inmovilizado en la segunda región (112) , en la capa de nitrocelulosa (1120) , para el reconocimiento del analito (1101) en la muestra líquida, en que el segundo anticuerpo (1121) y el primer anticuerpo (1111) están configurados para reconocer diferentes epítopos del analito (1101) en la muestra líquida; y un reactivo de sustrato (1132) localizado en la tercera región (113) , integrado en la capa de nitrocelulosa (1130) y que comprende una sacárido-oxidasa (1133) ,

en que el primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) , cuando esta se localiza en la primera región (111) , pueden conjugarse entre sí o en que, cuando la peroxidasa se localiza en la primera o en la segunda región (111, 112) , el primer anticuerpo (1111) puede conjugarse además con biotina, mientras que la peroxidasa (1113) se conjuga con una molécula seleccionada del grupo que consta de avidina, estreptavidina y neutravidina, con lo que se forma un complejo de biotina y avidina;

introducir (23) la muestra líquida en la primera región (111) del canal (11) para hacer que el primer anticuerpo (1111) , el sacárido (1112) y la peroxidasa (1113) , si la peroxidasa está localizada en la primera región (111) , fluyan conjuntamente con la muestra líquida; permitir (24) que el analito (1101) y una parte del primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) se unan al segundo anticuerpo (1121) , de modo que queden retenidos en la segunda región (112) ; permitir que el sacárido (1112) y la otra parte del primer anticuerpo (1111) y la peroxidasa (1113) fluyan a la tercera región (113) junto con la muestra líquida, de modo que el sacárido (1112) que llega a la tercera región es catalizado por la sacárido-oxidasa (1133) para producir peróxido de hidrógeno; permitir que la peroxidasa (1113) que llega a la tercera región (113) reaccione con el peróxido de hidrógeno, de modo que se genere una señal eléctrica; y

detectar (25) la señal eléctrica generada.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en que la capa de nitrocelulosa (1120, 1130) se prepara por vaciado de una disolución de nitrocelulosa en el fondo de la segunda y la tercera región (112, 113) , seguido de un proceso de secado.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en que cada una de las regiones segunda (112) y tercera (113) 15 tiene una anchura no inferior a 0, 3 mm.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en que el canal (11) comprende además una cuarta región con una capa de nitrocelulosa dispuesta en el fondo de la misma para acomodar el exceso de muestra líquida, en que dicha nitrocelulosa comprende una matriz hueca.