Taxón de actionomiceto marino para el descubrimiento de fármacos y de productos de fermentación.

Un actinomiceto marino aislado de la cepa Salinospora que tiene una exigencia absoluta de sodio para elcrecimiento,

que comprende secuencias de ARN 16Sr tal como se establece en SEQ ID NO: 4 y 5.

Taxón de actinomiceto marino para el descubrimiento de fármacos y de productos de fermentación Campo de la invención La invención se refiere al descubrimiento de un nuevo taxón de bacterias marinas del orden Actinomycetales y al

uso de este taxón para el descubrimiento y la producción de proteínas, metabolitos secundarios y biomoléculas para usar como composiciones farmacéuticas, productos agroquímicos, inmunomodificadores, enzimas e inhibidores de enzimas.

Antecedentes de la invención Los microorganismos que pertenecen a la clase Actinobacteria, comúnmente denominados actinomicetos, residen taxonómicamente dentro de las bacterias Gram-positivas y se ubican en ambientes terrestres. Los actinomicetos son una fuente prolífica de diversos metabolitos biológicamente activos. Han sido una fuente de numerosos productos de utilidad incluyendo productos farmacéuticos, agroquímicos, inhibidores de enzimas de bajo peso molecular, inmunomodificadores y enzimas para emplear en una cantidad de aplicaciones industriales, desde la industria alimenticia a la preparación del papel. Estos microorganismos también han sido de utilidad en agricultura como un medio de protección de agentes patógenos y mejora del crecimiento. A pesar de que se han descubierto muchas sustancias útiles a partir de los actinomicetos del suelo durante los últimos 60 años, el rendimiento de los nuevos productos se redujo drásticamente ya que las especies de suelo comunes dan continuamente los metabolitos previamente descubiertos. Por esta razón, se ha realizado un gran esfuerzo en descubrir nuevos taxones de actinomicetos con la esperanza de que estos microorganismos proporcionen una nueva fuente de productos de utilidad (Bull et al., 2000) .

Las actinobacterias son una de una cantidad de clases de bacterias. La clase Actinobacteria se puede subdividir posteriormente en seis órdenes, incluyendo Actinomicetales que se pueden dividir en 10 subórdenes. Los procedimientos clásicos para determinar la novedad taxonómica incluyen criterios morfológicos y fisiológicos, tales como color, presencia o ausencia de micelios, características de hifas ramificadas, patrón de esporas y motilidad,

tolerancia de variación en la temperatura, salinidad y pH y la capacidad de utilizar diversos sustratos. A pesar de que estos criterios son un importante componente de análisis taxonómicos, un novedoso procedimiento y más definitivo para establecer la exclusividad de cepa es el análisis de secuencias de rADN 16S, que también proporciona información evolutiva acerca del aislado (Stackebrandt, et al., 1997) .

La composición de una cepa dentro de la clase Actinobacteria está indicada por los valores de similitud de secuencia de rADN 16S de más del 80%, tal como se determina en comparación con las secuencias de rADN 16S casi completas con los miembros de ramificación más profundos de la clase y la presencia de nucleótidos de firma (Stackebrandt, 1997) . Los nucleótidos de firma específicos de un grupo taxonómico se seleccionan respecto de su presencia en más del 95% de los miembros de ese grupo. Las secuencias de nucleótidos de firma 16S se pueden usar en diversos niveles taxonómicos, desde la definición de un orden de bacterias hasta la subdivisión de familias en géneros. Este procedimiento proporciona un poderoso modelo matemático de evolución bacteriana y un grupo de reglas objetivas más que subjetivas por las cuales se pueden asignar a las bacterias un status taxonómico dentro del sistema de clasificación.

A pesar del hecho de que el océano cubre el 70% de la superficie de la Tierra, todos los géneros de actinomicetos conocidos descubiertos hasta la fecha han sido los habitantes de tierra. De hecho, sólo una especie de actinomiceto 40 marino fue descrita (Helmke y Weyland, 1984) y pertenece a un género terrestre bien conocido. A pesar de que los actinomicetos se cultivaron de sedimentos marinos, se cree ampliamente que los aislados marinos se derivan de esporas terrestres latentes que se lavaron en el mar (Goodfellow y Haynes, 1984) . La teoría de “lavado” se postuló porque los aislados marinos no requerían agua marina para el crecimiento, estaban íntimamente relacionados con las especies terrestres y tendían a reducirse en cantidad con una mayor distancia a la tierra (Goodfellow y Williams,

1983) . Como muchos actinomicetos terrestres pueden tolerar una alta salinidad y presión y debido a su distribución y fisiología, se concluyó que la mayoría de los actinomicetos fueron lavados en el mar y se recolectan en sedimentos donde pueden sobrevivir durante largos períodos como esporas (Goodfellow y Haynes, 1984) . Este tipo de estudios llevó a creer en general que los actinomicetos marinos no son significativamente diferentes de aquellos en tierra y, en consecuencia, tienen poca utilidad como fuente de nuevos productos industriales.

Resumen de la invención La invención es el descubrimiento, el aislamiento y la caracterización del primer taxón de actinomiceto marino obligado mayor para el cual se propone el nombre de Salinospora gen. nov. Los miembros de este género se reconocen con facilidad por medio de una serie de propiedades características que incluyen:

1. Exigencia absoluta de sodio (agua de mar) para el crecimiento.

2. Presencia de al menos 4 de los 5 nucleótidos de firma de rARN 16S (Tabla 3) y estrecha relación filogenética con el clado de Salinospora usando procedimientos de ramificación de rARN 16S.

3. Características morfológicas que típicamente incluyen:

a.) color de colonia que va de anaranjado a marrón,

b.) ningún o escaso micelio aéreo,

c.) pigmentos de tipo melanina difundibles y esporas que ennegrecen la superficie de la colonia,

d.) hifas que se ramifican finamente y no se fragmentan con esporas que se producen solas o en grupos.

4. Comparación con un depósito de un tipo de cepa en la ATCC (American Type Culture Collection; 12301 Parklawn Drive; Rockville, Mar y land 20852) el 27 de septiembre de 2000 bajo el número ATCC PTA-2501.

El descubrimiento del grupo Salinospora refuta las nociones anteriores acerca de los actinomicetos en el ambiente marino y proporciona la primera evidencia inequívoca de que mayores poblaciones de actinomicetos marino obligatorios exclusivos se producen ampliamente en sedimentos oceánicos. Estudios químicos de miembros del grupo de Salinospora llevaron al aislamiento de nuevos compuestos y una tasa excepcionalmente alta de extractos biológicamente activos que indican que estos microorganismos tienen utilidad para el descubrimiento de fármacos y otras aplicaciones industriales.

La invención es el uso del nuevo taxón para el descubrimiento y la producción de proteínas, metabolitos secundarios y otras biomoléculas para usar en composiciones farmacéuticas, agroquímicos, inmunomodificadores, enzimas e inhibidores de enzimas. Las moléculas activas se pueden purificar de actinomicetos en sí o metabolitos se pueden purificar de los medios de cultivo. Este género es una fuente rica de biomoléculas activas con muchas actividades farmacológicas demostradas (por ejemplo, antifúngicas, antimicrobianas, anticáncer) . Los extractos y productos se pueden usar en una cantidad de ensayos bien conocidos por los expertos en la técnica para determinar la actividad

de diversos compuestos derivados de los actinomicetos.

La invención es el uso del genoma del taxón para la producción de biomoléculas en el contexto de la cepa de actinomiceto endógeno o en otros organismos. Los genes se pueden expresar de forma individual o en grupos bajo el control de promotores constitutivos o inducibles. Los genes de la invención se pueden expresar en huéspedes heterólogos como cepas recombinantes o de superproducción. Otras partes del genoma, tales como elementos de regulación transcripcional, también se pueden utilizar en contextos heterólogos para el control de la transcripción. El genoma puede ser de tipo salvaje o mutante. Las mutaciones pueden ser espontáneas o se pueden crear de una manera aleatoria o dirigida a sitio por medio de procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.

La invención es el uso del taxón para la producción de productos génicos de organismos heterólogos. Los genes se pueden insertar ya sea de forma individual o en grupos en cepas de actinomicetos de la invención para la expresión 30 de proteínas, metabolitos secundarios u otras biomoléculas. Los compuestos se pueden aislar de los actinomicetos o los medios de crecimiento.

La invención es el uso del taxón para protección contra agentes patógenos y plagas, insecticidas, herbicidas, microbiocidas, promoción del crecimiento en aplicaciones de agricultura... [Seguir leyendo]

1. Un actinomiceto marino aislado de la cepa Salinospora que tiene una exigencia absoluta de sodio para el crecimiento, que comprende secuencias de ARN 16Sr tal como se establece en SEQ ID NO: 4 y 5.

2. Un actinomiceto marino aislado de la cepa Salinospora con depósito en la ATCC N.º PTA-2501 o una de sus 5 variantes o mutantes.

3. El actinomiceto marino aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cepa de Salinospora se obtiene del sedimento.

4. El actinomiceto marino aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que

comprende uno o varios nucleótidos de firma seleccionados del grupo que consiste en: U-A207, C-A207, A-C366, G10 C366, A-U467, G-U467, A-U468 y AG1456.

5. Un compuesto que tiene la estructura:

6. Un compuesto que tiene la estructura:

7. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6.

8. Una cepa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-4 para su uso en el tratamiento de uno o más de cáncer, infección bacteriana e infección fúngica.

9. Un procedimiento para producir una biomolécula que comprende:

crecimiento de una cepa de un actinomiceto marino con una exigencia absoluta de sodio para el crecimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la biomolécula es producida por la cepa de Salinospora;

la recolección de la cepa de Salinospora o el medio de crecimiento con contenido de sodio que contiene la biomolécula; y

la extracción de la biomolécula de la cepa de Salinospora o el medio de crecimiento que contiene el medio, 25 produciendo así la biomolécula.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la biomolécula es un agente farmacéutico.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el agente farmacéutico está seleccionado del grupo que comprende un agente antibiótico, un agente antifúngico y un agente anticáncer.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la biomolécula es un producto de un gen de un 30 organismo heterólogo.

13. Un procedimiento para el descubrimiento de fármacos que comprende:

el crecimiento de una cepa de un actinomiceto marino con una exigencia absoluta de sodio para el crecimiento de acuerdo con la reivindicación 1;

la recolección de la cepa de Salinospora o el medio de crecimiento con contenido de sodio que contiene la 5 biomolécula;

la extracción de la biomolécula de la cepa de Salinospora o el medio de crecimiento que contiene el medio; y

el análisis de la biomolécula o el medio de crecimiento que contiene sodio respecto de la actividad farmacológica.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el análisis de la biomolécula comprende un ensayo seleccionado del grupo que comprende un ensayo respecto de la actividad antibacteriana, un ensayo respecto de la actividad antiviral, un ensayo respecto de la actividad anticáncer y un ensayo respecto de la actividad antifúngica.

15. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 9-14, en el que, al recolectar el medio de crecimiento, la concentración del sodio del medio de crecimiento es de 450 mM.

16. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 5 ó 6 o una composición de

acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de uno o más de cáncer, infección bacteriana e infección fúngica.

Figura 1 Figura 2