Sistema de clasificación de células.

Un método de control de calidad interno para comprobar la calidad de unión de anticuerpos cuando el recuento de linfocitos CD4+ en una muestra biológica contiene dichos linfocitos CD4+,

monocitos y granulocitos, comprendiendo el método las etapas de:

a) hacer reaccionar un reactivo que consiste al menos en un anticuerpo marcado específico contra los antígenos de superficie celular CD4 con una primera parte de la muestra;

b) analizar las primeras señales en forma de un primer diagrama de puntos de dichos anticuerpos marcados que ha reaccionado con los antígenos de superficie celular CD4 sobre los monocitos y linfocitos y determinar en su interior la posición de un grupo de monocitos marcado;

c) analizar las señales secundarias en forma de un segundo diagrama de puntos de una segunda parte no marcada de la muestra y determinar en su interior la posición de un grupo de monocitos no marcados y

d) determinar un desplazamiento de la posición del grupo de monocitos marcados con respecto a la posición del grupo de monocitos no marcados y de este modo comprobar la calidad de unión de los anticuerpos del anticuerpo marcado sin necesidad de un control externo.

Sistema de clasificación de células Referencia cruzada con la solicitud relacionada La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos número 60/763.926, presentada el 31 de enero del 2006.

Campo de la invención:

La descripción se refiere al campo de ensayos biológicos donde las células pueden clasificarse y cuantificarse usando citometría de flujo y otros equipos ópticos. Más específicamente, la descripción se refiere al campo de control de calidad del recuento de subpoblaciones de células sanguíneas por citometría de flujo cuando las subpoblaciones de células sanguíneas se identifican uniéndose a anticuerpos marcados a antígenos de superficie celular. Estos resultados denominados “inmunohematológicos” se usan más frecuentemente para tratar el VIH/SIDA y prescribir su farmacoterapia. El alcance de protección se define en las reivindicaciones.

Antecedentes:

En el momento de la presente invención, aproximadamente 50 millones de personas en todo el mundo están infectadas por el VIH, muchas de las cuales están en una fase de su enfermedad en la que desde el punto de vista médico se ha indicado farmacoterapia antirretroviral. La estadificación de la enfermedad del VIH se realiza contando células inmunoespecíficas en sangre varias veces al año. El número de estas células disminuye progresivamente en un lapso de muchos años hasta un nivel donde la inmunidad se deteriora y se producen infecciones oportunistas letales. Desde el punto de vista médico a esta afección se la conoce como SIDA. Cuando para comprobar células inmunoespecíficas en sangre se usa recuento celular y los resultados se usan para medir el tiempo de la administración de la terapia antirretroviral, el procedimiento es 90% satisfactorio el establecer una remisión que dura varios años. Sin embargo esta tasa de remisión solo es de aproximadamente el 20%. Ahora se trata de un axioma incuestionable de que el recuento de células inmunitarias debe dirigir la terapia antirretroviral en el tratamiento del VIH.

Se calcula que el 95% de los individuos infectados por el VIH viven en regiones en las que no existe personal de laboratorio cualificado. Se requiere utilizar "citómetros de flujo" que son equipos usados para realizar el recuento de las células inmunitarias. Las agencias reguladoras clasifican a los citómetros de flujo como sistemas muy complejos porque requieren muchas etapas manuales cualificadas para preparar las muestras de sangre de los pacientes y son mecánica y electrónicamente inestables, lo que precisa un ajuste minucioso a lo largo del día. El tiempo de formación de un técnico de citometría de flujo se mide en años. La tasa a la cual la epidemia infecciosa del VIH ha desarrollado y establecido un índice de mortalidad que se calcula ahora que es de 6.000 al día, ha sobrepasado todos los esfuerzos para crear el suficiente número de técnicos y centros de citometría de flujo en las zonas del mundo menos desarrolladas.

La automatización con comprobaciones hardware y softward internas, tales como las desarrolladas por el sistema PointCare AuRICA (PointCare Technologies, Inc., Marlborough, MA Estados Unidos) , ha eliminado todas las etapas manuales necesarias para preparar muestras de análisis de citometría de flujo. Esto tendría un mayor impacto a formativo necesario utilizar citómetros de flujo si no fuese por otros dos problemas complicados. El primero es la formación de técnicos para usar materiales denominados de control externo (muestras de sangre artificial o sustitutiva analizadas) para verificar que el citómetro de flujo está funcionando realmente dentro de las especificaciones al principio y/o al final de cada día. El segundo es que estos materiales de control externo requieren una" cadena de frío" interrumpida durante su envío y conservación. El mantenimiento de una cadena de frío requiere formación e infraestructura de equipos de refrigeración que generalmente no existen en las zonas rurales en desarrollo. El camino crítico para desarrollar un citómetro de flujo que pueda usar el personal con una mínima formación en zonas con escasos recursos radica en la eliminación de materiales de control externos.

En ensayos de estado inmunitario, el papel principal de los materiales de control externos es garantizar que los anticuerpos, inestables, sensibles a la temperatura, que se usan como reactivos que se unen a antígenos de superficie celular y que clasifican células para el recuento, hayan conservado su capacidad de unión química. No basta con saber que se usa la concentración correcta del anticuerpo como reactivo. De hecho, tanto la concentración como la actividad de unión deben garantizarse para este reactivo clave. Los anticuerpos son proteínas termolábiles fácilmente vulnerables después de algunas horas en un laboratorio sin aire acondicionado. Cuando esto sucede, los recuentos celulares por citometría de flujo resultarán ser erróneos.

El principal problema con los controles externos en gran parte del mundo es que, al igual que los anticuerpos, son sensibles a la temperatura. Requieren distribuirse en condiciones de refrigeración y rara vez duran más de un mes, incluso en condiciones de refrigeración, una vez que se ha abierto el envase. No siempre se dispone de refrigeración fiable y esto crea problemas logísticos en clínicas lejanas y se requiere personal logístico bien formado en la clínica.

En segundo lugar, los controles externos son costosos. Algunas pequeñas clínicas necesitan invertir más dinero para ejecutar controles externos que para ejecutar muestras de pacientes. En tercer lugar, la calidad solo se garantiza en muestras de pacientes ejecutadas durante un tiempo específico después de ejecutar una muestra de control externo. Sería ventajoso si se garantizase la calidad en cualquier muestra del paciente independientemente de cuando se realice su ejecución.

El objeto de la presente descripción es un método y un equipo que usa las células sanguíneas del propio paciente durante la ejecución de la muestra en lugar de materiales de control externos, sustitutivos, para comprobar la concentración y actividad de los anticuerpos. Las células sanguíneas que se usan como un "control interno" no son las que se reducen en número durante el avance de la enfermedad del VIH. Las células de control interno son una clase de células inmunitarias que incluyen los mismos sitios de unión para los anticuerpos que los de la clase de células inmunitarias cuya población está afectada por el VIH. Estas células proporcionan un medio para comprobar la concentración y actividad de los anticuerpos que es independiente de la enfermedad y evita el coste de materiales de control externos. Adicionalmente ofrece la ventaja de proporcionar una comprobación de "material de control interno” simultánea, durante cada ejecución de la muestra de un paciente; una opción que no es factible ni desde el punto de vista económico ni desde el punto de vista técnico con materiales de control externo.

Sumario de la invención Las clases principales de leucocitos circulantes son linfocitos, monocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Cada una de ellas participa en diversos mecanismos complejos de defensa de enfermedades, y las desviaciones, desde una afección sin enfermedad o normal, en cuanto a la relación de números relativos entre los subconjuntos está muy correlacionada con patologías específicas. Durante la evolución del avance del VIH a SIDA declarado, se destruye una subclase de linfocitos creando eventualmente un estado inmunocomprometido donde el paciente es vulnerable a diversas infecciones oportunistas y a cáncer que se demuestra que es letal.

La subclase de linfocitos destruida por infección del VIH es una que incluye 94.000 ! 28.000 receptores de superficie por célula, conocida como receptor CD4 (Bikoue, A., et al, Cytometr y 1996; 26: 137) . Con esta subclase se han relacionado diversos nombres siendo el más común el de la subclase de “linfocitos T auxiliares” y el de la subclase de “linfocitos CD4+”. En el momento de la presente invención, un paciente infectado por VIH pasa al estado clínico de “SIDA declarado” cuando el recuento de linfocitos T auxiliares desciende a 200/∀l. Después de esto la defensa inmunitaria del paciente está casi perdida y sobreviene la muerte a partir de una infección oportunista irreversible (por ejemplo tuberculosis) o cáncer (sarcoma de Kaposi) .

Sin embargo, la clase de leucocitos circulantes realmente infectada por el virus (VIH) real, son los monocitos y no los linfocitos. Las rutas indirectas de señalización intercelular que actúan entre monocitos infectados y linfocitos T auxiliares... [Seguir leyendo]

1. Un método de control de calidad interno para comprobar la calidad de unión de anticuerpos cuando el recuento de linfocitos CD4+ en una muestra biológica contiene dichos linfocitos CD4+, monocitos y granulocitos, 5 comprendiendo el método las etapas de:

a) hacer reaccionar un reactivo que consiste al menos en un anticuerpo marcado específico contra los antígenos de superficie celular CD4 con una primera parte de la muestra; b) analizar las primeras señales en forma de un primer diagrama de puntos de dichos anticuerpos marcados que ha reaccionado con los antígenos de superficie celular CD4 sobre los monocitos y linfocitos y determinar en su interior la posición de un grupo de monocitos marcado; c) analizar las señales secundarias en forma de un segundo diagrama de puntos de una segunda parte no marcada de la muestra y determinar en su interior la posición de un grupo de monocitos no marcados y d) determinar un desplazamiento de la posición del grupo de monocitos marcados con respecto a la posición del

grupo de monocitos no marcados y de este modo comprobar la calidad de unión de los anticuerpos del anticuerpo marcado sin necesidad de un control externo.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, donde también se determina la posición de un grupo de granulocitos en dicho primer y segundo diagrama de puntos. 20

3. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, donde el desplazamiento de la posición del grupo de monocitos marcados a partir de la posición del grupo de monocitos no marcados se determina con respecto a la posición del grupo de granulocitos.

4. Un método como se reivindica en la reivindicación 2, donde el desplazamiento de la posición del grupo de monocitos marcados a partir de la posición del grupo de monocitos no marcados se determina a partir de las posiciones X-Y respectivas de dichos grupos en el primer y segundo diagrama de puntos.

5. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, donde el marcador emite luz fluorescente o luz dispersa. 30

6. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, donde un citómetro de flujo proporciona la primera y segunda señal.

Muestra de sangre en la que los eritrocitos se han eliminado por lisis.Misma muestra de sangre que la de la FIG. 1A pero usandoSe observan grupos de Linfocitos (L) , Monocitos (M) , y Granulocitos (G) inmunoconjugado con oro para marcar receptores de superficieNo se usó inmunoconjugado con oro.celular CD4. Los grupos de linfocitos se separan en linfocitos

-

CD4 y CD4+.Todo el grupo de monocitos está marcado y desplazado hacia la derecha (flecha) .

FIG. 1A FIG. 1B