Síntesis de ácido siálico en plantas.

Un método para sintetizar eI acido siálico que comprende,

i) el cultivo de una planta transgénica,

que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) liasa microbiano, la secuencia de nucleótidos ligada operativamente con una regiónreguladora que es activa en la planta, y

ii) la expresión de la secuencia de nucleótidos que sintetiza por lo tanto al acido siálico.

Síntesis de ácido siálico en plantas Campo de la invención La presente invención se relaciona con la síntesis del ácido siálico en plantas. Adicionalmente la presente invención proporciona los métodos y las plantas que producen el acido siálico, y las proteínas sialiladas producidas a partir de estas plantas.

Antecedentes de la invención Las plantas son potencialmente una fábrica segura de bajo costo y baja contaminación, para la producción de proteínas farmacéuticas recombinantes. La mayoría de las proteínas recombinantes producidas en las plantas no se distinguen de sus contrapartes de mamíferos, en cuanto a la secuencia de aminoácidos, conformación y actividad biológica. Adicionalmente, las glicoproteínas de mamífero son eficientemente glicosiladas cuando se expresan en plantas transgénicas. Sin embargo, las plantas producen moléculas con N-glicanos que difieren de aquellos encontrados en glicoproteínas de origen animal (Lerouge et al., 1998) . Esto puede limitar el uso de productos farmacéuticos elaborados a partir de plantas ya que la presencia de glicoepítopos específicos de las plantas sobre estas proteínas puede producir respuestas inmunes en humanos (Bardor et al., 2003) , así como la ausencia de epítopos del tipo mamífero, tal como las secuencias sialiladas, puede inducir su rápida eliminación del torrente sanguíneo. Como consecuencia, el control de la N-glicosilación de los productos farmacéuticos elaborados a partir de plantas, es un prerrequisito para su uso en terapia humana.

Recientemente han surgido estrategias de remodelación in planta para obtener anticuerpos derivados de las plantas con perfiles de carbohidratos compatibles con los humanos. Algunas estrategias involucran la retención de los planticuerpos en el retículo endoplasmático (Ko et al., 2003; Sriraman et al., 2004, Triguero et al., 2005) , otras involucran la transformación de las plantas con glicosiltransferasas de mamífero. Por ejemplo, la N-glicosilación de las plantas se puede humanizar parcialmente mediante la transformación de la planta con una (1, 4) galactosiltransferasa humana (Palacpac et al., 1999; Bakker et al., 2001) . La expresión de un anticuerpo de múrido en una planta transformada resulta en la producción de un anticuerpo derivado de la planta que albergan un perfil de galactosilación similar al observado en el correspondiente lgG de múrido (Bakker et al., 2001) .

Las lgG de mamífero portan N-glicanos bi-antenarios en el sitio conservado de la N-glicosilación localizado en el dominio Fc. Estos oligosacáridos están débilmente sialilados, y la ausencia del Neu5Ac terminal no interfiere con la función y estabilidad del anticuerpo. En contraste, la mayoría de las otras glicoproteínas en circulación tienen Nglicanos antenarios di, tri o tetra sialilados. Se requiere la presencia de ácidos siálicos terminales sobre estos glicanos para numerosas funciones biológicas, siendo la primera el control de la vida media de la proteína en el sistema circulatorio. En la ausencia de ácidos siálicos terminales, las glicoproteínas son detectadas por los receptores de asialoglicoproteína hepática y eliminados del suero, volviendo a estas proteínas de vida biológicamente corta e ineficaces (Kelm y Schauer, 1997) . Por lo tanto, los compuestos farmacéuticos no sialilados elaborados a partir de plantas pueden ser rápidamente eliminados del torrente sanguíneo cuando se inyectan a un humano, por ejemplo, una Epo derivada del tabaco era biológicamente activa in vitro pero no funcional in vivo, debido a su eliminación de la circulación antes de que alcance los tejidos eritropoyéticos (Matsumoto et al., 1995) .

La remodelación de los N-glicanos ligados a los planticuerpos en N-glicanos similares a los humanos, ya ha sido lograda parcialmente en plantas, mediante la expresión de una (1, 4) -galactosiltransferasa humana (Palacpac et al., 1999; Bakker et al., 2001) , una transferasa que utiliza la UDP-Gal endógena como co-sustrato. También se ha introducido una sialiltransferasa de mamífero en las plantas y se demostró que es funcional y se dirige correctamente al aparato de Golgi (Wee et al., 1998) . Sin embargo, no se observó sialilación de oligosacáridos endógenos. La presencia de ácidos siálicos así como la maquinaria de sialilación en plantas es todavía un tema de debate. Sin embargo, Neu5Ac, el principal ácido siálico presente en humanos, así como su precursor la Nacetilmanosamina (D-ManNAc) no parece que sean sintetizados en las plantas en cantidades detectables (Séveno et al., 2004) . Como consecuencia, la modificación por ingeniería genética del glicol de los N-glicanos de la planta en oligosacáridos sialilados necesita de la coexpresión de enzimas exógenas capaces de catalizar la síntesis, la activación y la transferencia en el aparato de Golgi de Neu5Ac.

En los mamíferos y las bacterias, el anabolismo y catabolismo de Neu5Ac ocurre a través de diferentes rutas (Angata y Varki, 2002) . Dos clases principales de enzimas se necesitan para formar Neu5Ac. La N-acetilneuraminato liasa (Neu5Ac liasa) está involucrada en el catabolismo de los ácidos siálicos mediante la catálisis de la escisión de Neu5Ac en N-acetilmanosamina (D-ManNAc) y piruvato en una reacción reversible. A altas concentraciones de D-ManNAc y piruvato, se puede desplazar el equilibrio a la síntesis de Neu5Ac. Acoplado a una actividad de la glucosamina 2-epimerasa, se utilizó Neu5Ac liasa de E. coli fue para la producción a gran escala de Neu5Ac a partir de D-GlcNAc (Maru et al., 1998) . De manera alternativa, las Neu5Ac sintasas, tales como NeuB, catalizan la condensación de ManNAc en fosfoenol piruvato (PEP) y están directamente involucradas en la biosíntesis de los ácidos siálicos (revisado en Tanner, 2005) .

Resumen de la invención La presente invención se relaciona con la síntesis del ácido siálico en plantas. Adicionalmente, la presente invención proporciona los métodos y las plantas que producen ácido siálico, y las proteínas sialiladas producidas a partir de estas plantas.

Un objetivo de la invención es el de proporcionar un método mejorado para la producción el ácido siálico en una planta.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para sintetizar acido siálico que comprende,

i) el cultivo de una planta transgénica, que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el ácido N-acetil neuramínico (Neu5Ac) liasa microbiano, la secuencia de nucleótidos ligada operativamente con una región reguladora que es activa en la planta, y

ii) la expresión de la secuencia de nucleótidos que sintetiza por lo tanto al acido siálico.

Adicionalmente, después de la etapa de crecimiento, se puede recuperar el ácido siálico de la planta. La región reguladora se puede seleccionar del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, y un promotor de desarrollo.

La presente invención también se refiere al método definido anteriormente, en donde la planta incluye además una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una epimerasa, una CMP-Neu5Ac sintasa, o un transportador de CMP-Neu5Ac, operativamente enlazado a una o más de una segunda región reguladora activa dentro de Ia planta, y Ia segunda secuencia de nucleótidos es coexpresada junto con la expresión de la secuencia de nucleótidos. Adicionalmente, la segunda región reguladora se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, y un promotor de desarrollo.

La presente invención también se refiere al método como se describió anteriormente, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica Neu5Ac sintasa, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una de la epimerasa, CMP-Neu5Ac sintasa, o el transportador de CMP-Neu5Ac, o tanto la secuencia de nucleótidos, como la segunda secuencia de nucleótidos es optimizada por el codón para la expresión dentro de la planta.

La presente invención proporciona una planta, una célula de una planta, o una semilla, que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica la Neu5Ac liasa microbiana operativamente enlazada con una región reguladora que es activa en la planta. La planta, la célula de la planta o la semilla pueden contener además una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una epimerasa, una CMP-Neu5Ac sintasa, un transportador de CMP-Neu5Ac, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa, operativamente enlazadas a una o más de una segunda región reguladora activa dentro de la planta. Adicionalmente, la región reguladora y la segunda región reguladora se pueden seleccionar a... [Seguir leyendo]

1. Un método para sintetizar eI acido siálico que comprende,

i) el cultivo de una planta transgénica, que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el ácido N-acetil neuramínico (Neu5Ac) liasa microbiano, la secuencia de nucleótidos ligada operativamente con una región reguladora que es activa en la planta, y

ii) la expresión de la secuencia de nucleótidos que sintetiza por lo tanto al acido siálico.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido siálico es Neu5Ac, y en donde después de la etapa de expresión, la Neu5Ac se recupera a partir de la planta transgénica.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la región reguladora se selecciona del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, y un promotor de desarrollo.

4. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la planta transgénica comprende además una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una epimerasa, una CMP-Neu5Ac sintasa, o un transportador de CMP-Neu5Ac, operativamente enlazados a una o más de una segunda región reguladora activa dentro de la planta transgénica, y la segunda secuencia de nucleótidos se coexpresa junto con la expresión de la secuencia de nucleótidos.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la segunda región reguladora se selecciona del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, y un promotor de desarrollo.

6. El método de la reivindicación 4 o 5, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la Neu5Ac liasa, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una entre la epimerasa, la CMP-Neu5Ac sintasa, o el transportador de CPM-Neu5Ac, o tanto la secuencia de nucleótidos, como la segunda secuencia de nucleótidos es optimizada por el codón para expresión dentro de la planta.

7. Un método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la planta transgénica es transformada en forma transitoria.

8. Una planta, una célula de una planta, o una semilla, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una Neu5Ac sintasa microbiana operativamente enlazada con una región reguladora que es activa en la planta.

9. La planta, la célula de la planta o la semilla de la reivindicación 8, que comprende además una segunda secuencia de nucleótidos que codifica de una o más de una epimerasa, una CMP-Neu5Ac sintasa, un transportador de CMP-Neu5Ac, una galactosiltransferasa, y una sialiltransferasa, operativamente enlazadas a una o más de una segunda región reguladora activa dentro de Ia planta, célula de la planta, o Ia semilla.

10. La planta, la célula de la planta o la semilla de la reivindicación 9, en donde la primera y la segunda regiones reguladoras se seleccionan del grupo que consiste de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido, y un promotor de desarrollo.

11. La planta, célula de la planta o la semilla de la reivindicación 9 o 10, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la Neu5Ac liasa, la segunda secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una epimerasa, CMP-Neu5Ac sintasa, o un transportador de CMP-Neu5Ac, o tanto la secuencia de nucleótidos, como la segunda secuencia de nucleótidos es optimizada por eI codón para Ia expresión dentro de la planta, célula de la planta, o la semilla.