Procedimiento de separación de proteínas por electroforesis capilar y composiciones tampón para electroforesis capilar.

Procedimiento de electroforesis capilar en disolución libre a pH alcalino para el análisis de muestras quecomprende unos constituyentes proteicos entre los cuales hay uno (o unos) constituyente(s) lipoproteico(s),

siendolos constituyentes proteicos la albúmina y las fracciones a1-, a2-, b- o (b1- y b2-), g-globulina, y siendo losconstituyentes lipoproteicos la a-lipoproteína, la b-lipoproteína y/o la pre-b-lipoproteína, caracterizado porquecomprende por lo menos una etapa en la que:

se introduce la muestra en un tubo capilar que contiene un tampón de análisis, comprendiendo dicho tampón deanálisis además por lo menos un aditivo de tipo surfactante aniónico capaz de interacción hidrófoba con el (o los)constituyente(s) lipoproteico(s), y de modificar su movilidad electroforética, con respecto a la de los otrosconstituyentes proteicos,

comprendiendo dicho aditivo una parte hidrófoba compuesta por lo menos por una cadena alquilo de C10 a C24,ramificada o no, que comprende una parte lineal de por lo menos 10 átomos de carbono, y un polo aniónicoconstituido por uno o varios grupos seleccionado(s) de entre los sulfonatos, carboxilatos, sulfatos o fosfatos,siendo la concentración en aditivo en el tampón superior a 0,001 mM e inferior a 0,1 mM.

Procedimiento de separación de proteínas por electroforesis capilar y composiciones tampón para electroforesis capilar.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la separación de proteínas y péptidos por electroforesis capilar, así como a unas composiciones tampón que comprenden un aditivo útil para esta separación, en presencia de lipoproteínas en la muestra.

Es conocido analizar el índice de proteínas en líquidos biológicos como el suero, con objetivos analíticos y en particular diagnósticos, y habitualmente separar unas proteínas por electroforesis, tanto en electroforesis sobre gel como electroforesis capilar. Uno de los intereses de la electroforesis capilar reside en el hecho de que se necesitan cantidades muy pequeñas de líquidos biológicos a analizar. Además, la separación mediante esta técnica puede ser muy rápida, en la medida en la que se pueden utilizar fuertes voltajes sin que la muestra se caliente demasiado durante la separación.

Para la separación de las proteínas séricas, se efectúa clásicamente la electroforesis capilar con unos tampones alcalinos. Habitualmente, los perfiles proteicos obtenidos comprenden cinco o seis fracciones que corresponden a los constituyentes proteicos que son la fracción albúmina, las fracciones α1- y α2-globulina, la fracción β-globulina o las fracciones β1- y β2-globulina, y la fracción γ-globulina. Cada una de estas fracciones comprende una o varias proteínas séricas.

Dichas separaciones se pueden realizar mediante electroforesis capilar, en particular con la ayuda de tampones de análisis y técnicas tales como se describen en las patentes US Re 36 011, EP 518 475, o EP 1 229 325 y EP 1 258 724.

La separación de las proteínas séricas es, sin embargo, insatisfactoria.

En efecto, por “constituyente proteico”, se entiende en este caso no sólo los constituyentes proteicos que son las fracciones α1-; α2-; β- o β1- y β2- y γ-globulina, sino también los constituyentes lipoproteicos que son principalmente las α-lipoproteínas, β-lipoproteínas y pre-β-lipoproteínas también denominadas HDL, LDL y VLDL por “High Density Lipoproteine”, “Low Density Lipoproteine” y “Ver y Low Density Lipoproteine”. Ahora bien, los perfiles son a veces imprecisos especialmente a causa de estas lipoproteínas, y principalmente de la β-lipoproteína y la pre-βlipoproteína, que aparecen en la zona de los perfiles que corresponden a las α1- y α2-globulinas y β1-globulina.

La solicitante ha puesto de manifiesto ahora que, utilizando un surfactante aniónico, como un aditivo en el tampón de análisis, será posible obtener una separación mejorada, y especialmente un perfil limpio en la zona de las α1-, α2- y β-globulinas del perfil electroforético. Estos aditivos se seleccionan de entre los surfactantes aniónicos capaces de interacciones hidrófobas con uno o varios constituyentes lipoproteicos, y en particular los residuos hidrófobos de las lipoproteínas. Pueden aportar a este o a estos constituyentes lipoproteicos una o varias cargas negativas. Pueden modificar, y en particular disminuir, la movilidad electroforética con respecto a la de los demás constituyentes proteicos.

A bajas concentraciones en aditivo utilizadas según la invención, concentraciones muy bajas con respecto a las concentraciones utilizadas para estos aditivos en otras aplicaciones, los perfiles obtenidos en electroforesis capilar pueden presentar unos picos más puros, exentos de apoyo en particular en lo que se refiere a las fracciones α1 y α2, como aparece en los ejemplos. Esto tiene un gran interés para la explotación de los perfiles de muestras de suero hiperlipémicas en particular, y presenta un cierto interés también durante el análisis de muestras normolipémicas.

Así, la invención se refiere a un procedimiento de electroforesis capilar en disolución libre a pH alcalino para el análisis de muestras que comprenden constituyentes proteicos, entre ellos uno (o unos) constituyente (s) lipoproteico (s) según la reivindicación 1.

Este aditivo es capaz de aportar a este (estos) constituyente (s) lipoproteico (s) una o varias cargas negativas y modificar la movilidad electroforética, con respecto a la de los demás constituyentes proteicos, no lipídicos.

Esta etapa está generalmente seguida de la separación de los constituyentes proteicos por migración y detección de los constituyentes.

Se describe asimismo un procedimiento de separación por electroforesis de los constituyentes proteicos de muestras que comprenden por lo menos albúmina y las fracciones α1-, α2- y β-globulina, así como unas lipoproteínas, en un tampón de análisis, en el que el tampón de análisis comprende además por lo menos un aditivo surfactante aniónico capaz de interacción hidrófoba con las lipoproteínas.

Se describe asimismo un procedimiento de separación electroforética, por electroforesis capilar a pH alcalino en disolución libre, de los constituyentes proteicos de una muestra líquida que comprende unas lipoproteínas, procedimiento en el que se hace pasar la muestra que comprende dichos constituyentes por un capilar que contiene un tampón de análisis que comprende además por lo menos un aditivo capaz de interactuar específicamente con las lipoproteínas; el aditivo puede ser un surfactante aniónico que comprende una parte hidrófoba, como una cadena alquilo de C10 a C20, y una parte aniónica que aporta una carga negativa fuerte a un pH superior a 9.

El aditivo de tipo surfactante aniónico se utiliza a concentraciones bajas en el tampón, de manera que la interacción sigue baja sobre la albúmina y los demás constituyentes proteicos no lipídicos y particularmente centrada en las lipoproteínas, lo cual se denomina en la presente memoria “específico a las lipoproteínas”. En efecto, para una interacción específica de este tipo con las lipoproteínas, es preferible utilizar el aditivo de tipo surfactante aniónico a concentraciones bajas. Estas concentraciones dependen, para cada surfactante aniónico, de su afinidad para las lipoproteínas, por un lado, y de su afinidad para la albúmina y los otros constituyentes proteicos no lipídicos, por otro lado. La concentración óptima es así diferente para cada surfactante. Puede ser del orden de menos de 1 mM en el tampón, por ejemplo del orden de 0, 001 a 0, 2 mM, preferiblemente superior a 0, 01 e inferior a 0, 1 mM, por ejemplo estar comprendida entre 0, 01 mM y 0, 09 mM, por ejemplo.

La solicitante ha constatado, en particular para el SDS, que una concentración de aproximadamente 0, 05 mM no conlleva un desplazamiento suficiente de los constituyentes lipoproteicos, y que una concentración superior a 0, 2 mM deforma los perfiles (disminución de las fracciones β2 y α1 a 0, 25 mM) , e incluso conduce, a 0, 5 mM, a una deformación total de los perfiles.

Así, los compuestos útiles como aditivo para tampón de análisis en electroforesis capilar de la invención capaces de interacción hidrófoba específica con las lipoproteínas pueden ser unos surfactantes aniónicos tales como los utilizados en MECC (Micellar Electrokinetic Capillar y Chromatography) , pero a una concentración claramente inferior a su concentración micelar crítica. En la presente invención, estos compuestos se utilizan en EC en disolución libre como se ha indicado anteriormente, hay una aportación de cargas negativas sobre las lipoproteínas por interacción hidrófoba entre los residuos hidrófobos de estas lipoproteínas y la parte hidrófoba de estos compuestos, dando como resultado una migración ralentizada de estas lipoproteínas con respecto a la de las demás proteínas. Una de las consecuencias es la separación mejorada de las fracciones α1, α2 y β1, migrando las lipoproteínas fuera de las zonas a las que migran habitualmente, es decir en las zonas α1, α2 y β1. Se utilizan asimismo a una concentración inferior a las concentraciones descritas en EP 1 229 325.

Además, la invención se refiere a la utilización de una composición para la electroforesis capilar según la reivindicación 19. En un soporte aceptable, en presencia de por lo menos un tampón, se describe que un aditivo del tipo surfactante aniónico tal como se ha definido anteriormente, es capaz de hacer migrar las lipoproteínas fuera de las zonas a las que migran habitualmente, en particular fuera de las zonas de las fracciones α1, α2 y β1.

Como aparece en los ejemplos, la utilización de aditivos según la invención permite... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de electroforesis capilar en disolución libre a pH alcalino para el análisis de muestras que comprende unos constituyentes proteicos entre los cuales hay uno (o unos) constituyente (s) lipoproteico (s) , siendo los constituyentes proteicos la albúmina y las fracciones α1-, α2-, β- o (β1- y β2-) , γ-globulina, y siendo los constituyentes lipoproteicos la α-lipoproteína, la β-lipoproteína y/o la pre-β-lipoproteína, caracterizado porque comprende por lo menos una etapa en la que:

se introduce la muestra en un tubo capilar que contiene un tampón de análisis, comprendiendo dicho tampón de análisis además por lo menos un aditivo de tipo surfactante aniónico capaz de interacción hidrófoba con el (o los) constituyente (s) lipoproteico (s) , y de modificar su movilidad electroforética, con respecto a la de los otros constituyentes proteicos,

comprendiendo dicho aditivo una parte hidrófoba compuesta por lo menos por una cadena alquilo de C10 a C24,

ramificada o no, que comprende una parte lineal de por lo menos 10 átomos de carbono, y un polo aniónico constituido por uno o varios grupos seleccionado (s) de entre los sulfonatos, carboxilatos, sulfatos o fosfatos, siendo la concentración en aditivo en el tampón superior a 0, 001 mM e inferior a 0, 1 mM.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la separación de los 20 constituyentes por migración y la detección de estos constituyentes.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la muestra es biológica.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la muestra es una muestra de 25 suero, sangre hemolizada, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los constituyentes son séricos.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho aditivo comprende un polo 30 aniónico con un pH superior a 9 y una parte hidrófoba.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho aditivo se selecciona de entre los surfactantes aniónicos como los alquil C10-C24-mono-, di- o tri-sulfatos, los alquil C10-C24-mono, di- o trisulfonatos, los alquil C10-C24-mono-, di-o tri-carboxilatos, los alquil C10-C24-mono-, di- o tri-fosfatos y los alquil C10

C24-carboxi-sulfonatos, -sulfatos y -fosfatos, y en particular los alquilsulfatos C10 a C24.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el aditivo es un alquil C10-C20sulfato.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el aditivo es el dodecilsulfato de sodio.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la concentración en aditivo en el

tampón está comprendida entre 0, 01 mM y 0, 09 mM. 45

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la concentración de aditivo en el tampón es del orden de 0, 07 mM.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el tampón comprende además un

aditivo de tipo octanosulfonato, a una concentración en dicho tampón comprendida entre 1 mM y 10 mM, preferiblemente entre 2, 5 y 5 mM.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el pH de dicho tampón de análisis está comprendido entre 9 y 11. 55

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el capilar es de sílice fundida.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el tampón de análisis comprende

además por lo menos un modificador de pH. 60

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque el modificador de pH se selecciona de entre el hidróxido de litio, el hidróxido de sodio, el hidróxido de potasio, el hidróxido de rubidio, el hidróxido de cesio, el hidróxido de francio, un hidróxido de mono-, di-, tri- o tetra-alquil-amonio que tiene de 1 a 8 átomos de carbono en la parte alquilo.

17. Procedimiento de separación electroforética según la reivindicación 1, mediante electroforesis capilar a pH alcalino en disolución libre, de los constituyentes proteicos de una muestra líquida, procedimiento en el que se hace pasar la muestra que comprende dichos constituyentes por un capilar que contiene un tampón de análisis capaz de interactuar con las lipoproteínas que comprenden además por lo menos un aditivo, siendo el aditivo un compuesto que comprende un polo aniónico cargado negativamente a un pH superior a 9 y una parte hidrófoba que comprende por lo menos una cadena alquilo de C10 a C20, y siendo la concentración en aditivo en el tampón superior a 0, 001 mM e inferior a 0, 1 mM.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque el tampón de análisis comprende además sulfato de sodio o de litio.

19. Utilización de una composición para la electroforesis capilar en disolución libre a pH alcalino para el análisis de muestras que comprende unos constituyentes proteicos de los cuales uno (o unos) constituyente (s) proteico (s) es (son) la albúmina y las fracciones α1-, α2-, β- o (β1- y β2-) , γ-globulina y unos constituyentes lipoproteicos α-lipoproteína, β-lipoproteína y/o pre-β-lipoproteína, comprendiendo dicha composición por lo menos un tampón y además por lo menos un aditivo capaz de interacción hidrófoba con las lipoproteínas en un soporte aceptable, comprendiendo el aditivo una parte hidrófoba compuesta por lo menos por una cadena alquilo de C10 a C24, ramificada o no, que comprende por lo menos una cadena lineal de 10 átomos de carbono, y un polo aniónico constituido por uno o varios grupos seleccionado (s) de entre los sulfonatos, carboxilatos, sulfatos y fosfatos, siendo la concentración en aditivo en el tampón superior a 0, 001 mM e inferior a 0, 1 mM.

20. Utilización según la reivindicación 19, caracterizada porque dicho aditivo se selecciona de entre los surfactantes aniónicos como los alquil C10-C24-mono-, di- o tri-sulfatos, los alquil C10-C24-mono, di- o tri-sulfonatos, los alquil C10C24-mono-, di-o tri-carboxilatos, alquil C10-C24-mono-, di- o tri-fosfatos y alquil C10-C24-carboxi-sulfonatos, -sulfatos y -fosfatos, y en particular los alquilsulfatos C10 a C24.

21. Utilización según una de las reivindicaciones 19 o 20, caracterizada porque dicho aditivo se selecciona de entre los surfactantes aniónicos alquilsufatos C10 a C20, y sus mezclas.

22. Utilización según una de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizada porque el aditivo es un alquilsulfato C10 a C16.

23. Utilización según una de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizada porque el aditivo es el dodecilsulfato de sodio.

24. Utilización de un estuche de análisis de constituyentes proteicos en una muestra biológica, para la electroforesis capilar en disolución libre a pH alcalino para el análisis de muestras que comprenden unos constituyentes proteicos de los cuales uno (o unos) constituyente (s) proteico (s) es (son) la albúmina y las fracciones α1-, α2-, β- o (β1- y β2-) , γ-globulina y unos constituyentes lipoproteicos α-lipoproteína, β-lipoproteína y/o pre-β-lipoproteína, con la ayuda de una composición según una de las reivindicaciones 19 a 23, comprendiendo dicho estuche por lo menos un tampón de análisis y un aditivo de tipo surfactante aniónico, capaz de hacer migrar las lipoproteínas fuera de las zonas a las que migran habitualmente, en particular fuera de las zonas de las fracciones α1, α2 y β1 y/o que comprende una parte hidrófoba, como una cadena alquilo de C10 a C20, y una parte aniónica que aporta una carga negativa fuerte a un pH superior a 9, siendo la concentración en aditivo en el tampón superior a 0, 001 mM e inferior a 0, 1 mM después de la eventual mezcla del tampón y del aditivo; y

una (o unas) disolución (es) de lavado de los capilares y/o uno (o unos) diluyente (s) apropiado (s) y/o unas tiras de dilución.