Método de separación, de identificación y de cuantificación de las isofosfatasas alcalinas por electroforesis.

Procedimiento de separación por electroforesis, a partir de una muestra biológica,

de las isoenzimas de lafosfatasa alcalina (ALP), caracterizado porque comprende:

- depositar sobre un soporte de electroforesis la muestra biológica que contiene las isoenzimas de la ALP aseparar;

- depositar en una zona determinada localizada del soporte de electroforesis, una solución de lectina capaz deinteractuar con las isoenzimas de la ALP contenidas en la muestra;

- aplicar un campo eléctrico para permitir la interacción entre dicha lectina y las isoenzimas de la ALPcontenidas en la muestra biológica analizada, y separación electroforética, por migración de las isoenzimasde la ALP bajo unas condiciones que permiten la separación diferencial de las fracciones ósea y hepática dela ALP;

- revelar las isoenzimas separadas de la ALP.

Método de separación, de identificación y de cuantificación de las isofosfatasas alcalinas por electroforesis.

La fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) (abreviatura ALP) , es una metaloenzima que consiste en un grupo de isoenzimas, presentes en diferentes tejidos de los organismos animales, y en particular en el hombre.

Las isoenzimas de la fosfatasa alcalina presentan un interés en protocolos de diagnóstico de diferentes afecciones en el adulto o en el niño, y por lo tanto se han propuesto varios métodos para la separación y la medición de estas isoenzimas. Las isoenzimas de la ALP se pueden distribuir en cuatro clases: tisular no específica (hueso, hígado y riñón) , intestinal adulta, intestinal fetal, placentaria. En el seno de una misma clase, pueden existir algunas variantes, a saber:

-hepáticas: hepática 1 (H1) , hepática 3 (H2) ,

- ultra-rápida UF;

- ósea (Hueso) -placentarias: placentaria 1 (P1) , placentaria 2 (P2) ; -intestinales: intestinal 1 (I1) , intestinal 2 (I2) , intestinal 3 (I3) .

Por lo tanto, se distinguen nueve fracciones principales, que conviene poder separar, identificar y cuantificar, en particular con vistas a su investigación en patologías hepáticas y biliares, así como también en ciertas enfermedades de los huesos, que incluyen los tumores óseos, o en la enfermedad de Paget.

Algunas veces se utilizará a continuación el término “fracción” para designar una clase de isoenzimas de la ALP o una variante particular en el seno de una clase de isoenzimas. Sobre el soporte de electroforesis, una “fracción” corresponde a una banda revelada después de la migración.

El análisis de rutina más practicado sobre las isoenzimas de la fosfatasa alcalina consiste en medir la actividad enzimática total mediante un sustrato de esta enzima, generalmente el paranitrofenilfosfato. Sin embargo, este método no permite obtener la tasa de las diferentes isoenzimas.

El principal método de separación de análisis de estos compuestos recurre a las técnicas electroforéticas. Así, algunas veces se usa la isoelectroenfoque, que permite obtener una separación de 10 a 20 bandas en función de la técnica empleada. La identificación de todas estas bandas es difícil, lo cual convierte a la interpretación clínica en extremadamente delicada.

La electroforesis de zona permite separar convenientemente las principales formas de isofosfatasas. Sin embargo, algunas fracciones están superpuestas, en particular las fracciones Os, H1, P1 y por consiguiente deben efectuarse tratamientos complementarios para separarlas e identificarlas. Estos tratamientos deben realizarse sobre muestras biológicas ensayadas antes de su deposición sobre gel.

Estos tratamientos consisten por ejemplo en una desnaturalización térmica, una incubación con inhibidores específicos tales como urea, aminoácidos, etc., una incubación enzimática con neuraminidasa, ficina, fosfolipasa C, una incubación con antisueros específicos, antiplacentarios o anti-intestinales.

Se han abordado diferentes técnicas de separación practicadas actualmente en Van Hoof V.O., De Broe Marc, E., Clinical Laborator y Sciences, vol. 31, (3) 1994, Interpretation and clinical significance of alkaline phosphatase isoenzyme patterns.

Una técnica particular se ha propuesto en la patente US n°5.264.098 que describe la separación de las isoenzimas de la ALP mediante una reacción de electroforesis sobre gel que emplea un tampón de gel que contiene por lo menos un detergente no iónico y un detergente aniónico.

Los tratamientos disponibles para la identificación y la cuantificación de las isoenzimas de la ALP presentan algunos inconvenientes para el análisis de rutina. Además de sus elevados costes, pueden ser por una parte largos y hacer considerablemente pesada la manipulación, y por otra parte, para una determinación completa (de la totalidad de las isoenzimas) , es necesario realizar varios tratamientos (2 a 3) para una sola muestra, lo cual limita la cantidad de muestras que pueden ser simultáneamente analizadas sobre un mismo gel.

Se han propuesto otros tratamientos, que prevén por ejemplo el tratamiento de la muestra previamente a la deposición de la muestra sobre el gel de electroforesis. En este marco, la acción de la lectina WGA (Wheat Germ Agglutinin) , es particularmente interesante (véase Sidney B. Rosalski, A. Ying Foo, Clinical Chemistr y , 30/7, p. 11821186, 1984, Two new methods for separating and quantifying bone and liver alkaline phosphatase isoenzyme in plasma, patente EP 0 131 606 del 5/11/86) . La patente EP 0 131 606 describe de este modo la detección diferenciada de la isoenzima de la ALP de los huesos y del hígado, que comprende el tratamiento de la muestra ensayada con lectina y luego la incubación de la mezcla obtenida seguida de la separación de la ALP ligada a la lectina, de la fracción que contiene la ALP libre, y de la determinación en uno de los dos medios o en los dos, de la actividad ALP. Según un modo de realización particular de esta patente, la separación de las dos fracciones (ALP ligada a la lectina y ALP libre) se realiza por electroforesis.

Con excepción de las formas intestinales, todas las isofosfatasas poseen ácidos siálicos y por lo tanto están más o menos afectadas por un tratamiento con lectina WGA. Siendo la fracción ósea la más sialilada, es la que se verá más afectada por este tratamiento que le confiere, bajo condiciones apropiadas, un retardo de movilidad y por ello, la conduce a precipitarse en una zona distinta con respecto a la zona de localización de la fracción hepática.

Con el fin de convertir a la precipitación de las isoenzimas de ALP en más selectiva frente a la isoenzima ósea, algunos autores han utilizado detergentes tales como por ejemplo triton X 100 (Rosalki) . Pero, a pesar la presencia de estos detergentes, subsisten unas interacciones residuales de la lectina WGA con otras isofosfatasas que provocan unas coprecipitaciones de estas fracciones con la fracción ósea.

Además de esta falta de especificidad, otro inconveniente de esta técnica es que complica considerablemente el análisis.

La publicación Rosalki S.B. et al citada anteriormente propone, alternativamente, la incorporación de lectina en el tampón utilizado para impregnar el gel de electroforesis, previamente a la utilización de este gel. Esto permite eliminar el tratamiento previo de la muestra. En este caso, la mayor parte de la fracción ósea precipita en la proximidad de la deposición de la muestra. Todas las otras isoenzimas con excepción de las isoenzimas intestinales, tienen su movilidad afectada por la acción de lectina WGA y, esto sucede a pesar de la presencia de los detergentes mencionados anteriormente.

En el marco de este tratamiento, las propiedades de la lectina empleadas, son su capacidad para interactuar específicamente con las isoenzimas de la ALP que poseen ácidos siálicos.

La patente US no 5.667.654 describe la deposición de un reactivo después de la separación electroforética de los constituyentes de una muestra y después de que dichos constituyentes separados han sido mantenidos en un estado estático particular. Entre las actividades susceptibles de ser reveladas por un reactivo, figura la actividad fosfatasa alcalina.

La presente invención propone unos medios para superar, por lo menos en parte, los inconvenientes constatados en los métodos de la técnica anterior. En particular, la invención define un método que permite una separación y una identificación de las isoenzimas de la ALP, mejorada en el plano de la especificidad y de la sensibilidad.

La presente invención pone además a disposición de los usuarios y en particular de los clínicos, un procedimiento de separación, de identificación y de cuantificación de las principales isofosfatasas alcalinas, realizable en una sola etapa, sobre un soporte de electroforesis único fácil de producir.

La invención tiene por lo tanto por objeto un nuevo procedimiento de separación y de identificación de las isoenzimas de la ALP, por electroforesis, caracterizada porque se deposita la lectina, de manera localizada sobre el soporte de electroforesis.

La lectina depositada en solución de manera localizada, se puede difundir en el soporte, quedando al mismo tiempo localizada en una zona determinada de este soporte durante la migración electroforética.

La deposición en cuestión localizada en la proximidad de la zona de deposición de la muestra, se desmarca de la deposición uniforme sobre una zona extendida o sobre la totalidad del soporte de electroforesis, descrita en el estado de la técnica.

La invención, según la... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de separación por electroforesis, a partir de una muestra biológica, de las isoenzimas de la fosfatasa alcalina (ALP) , caracterizado porque comprende:

- depositar sobre un soporte de electroforesis la muestra biológica que contiene las isoenzimas de la ALP a separar;

- depositar en una zona determinada localizada del soporte de electroforesis, una solución de lectina capaz de interactuar con las isoenzimas de la ALP contenidas en la muestra;

- aplicar un campo eléctrico para permitir la interacción entre dicha lectina y las isoenzimas de la ALP contenidas en la muestra biológica analizada, y separación electroforética, por migración de las isoenzimas de la ALP bajo unas condiciones que permiten la separación diferencial de las fracciones ósea y hepática de la ALP;

- revelar las isoenzimas separadas de la ALP.

2. Procedimiento de separación por electroforesis según la reivindicación 1, caracterizado porque la separación electroforética de las isoenzimas de la ALP está seguida por una etapa de análisis cuantitativo de las diferentes isoenzimas de la ALP separadas.

3. Procedimiento de separación por electroforesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la deposición de la solución de lectina y la deposición de la muestra biológica se efectúan simultáneamente.

4. Procedimiento de separación por electroforesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la deposición de la solución de lectina se realiza posteriormente a la deposición de la muestra biológica.

5. Procedimiento de separación por electroforesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la deposición de la solución de lectina se realiza antes de la deposición de la muestra biológica.

6. Procedimiento de separación por electroforesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la duración de la deposición de la solución de lectina y/o la duración de la deposición de la muestra están comprendidas entre 5 y 20 minutos.

7. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la concentración de la solución de lectina está determinada en función de la temperatura del soporte de electroforesis y de la duración de la aplicación de la solución de lectina sobre el soporte.

8. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la solución de lectina tiene una concentración comprendida entre 0, 1 mg/ml y su límite de solubilidad en el agua.

9. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la solución de lectina tiene una concentración comprendida entre 1 y 10 mg/ml.

10. Procedimiento de separación por electroforesis según la reivindicación 9, caracterizado porque cuando la concentración de la solución de lectina está comprendida entre 1 y 10 mg/ml, la temperatura de migración está comprendida entre respectivamente 18ºC y 53ºC.

11. Procedimiento de separación por electroforesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la concentración de la solución de lectina está determinada en función de la temperatura máxima alcanzada en el seno del soporte de electroforesis durante la etapa de la migración.

12. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque, cuando las isoenzimas de la ALP presentan una movilidad en dirección al ánodo, la lectina se deposita entre el ánodo y la muestra biológica.

13. Procedimiento de separación por electroforesis según la reivindicación 12, caracterizado porque la lectina se deposita entre la muestra biológica y la zona ocupada normalmente por la fracción intestinal 3 (I3) al final de la etapa de migración, cuando esta fracción está presente en la muestra.

14. Procedimiento de separación por electroforesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la lectina es lectina de gérmenes de trigo (Wheat Germ Agglutinin o WGA) .

15. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el soporte de electroforesis es un gel de agarosa o de poliacrilamida.

16. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el soporte de electroforesis es una membrana de acetato de celulosa.

17. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque se cuantifican las fracciones de la ALP reveladas.

18. Procedimiento de separación por electroforesis según la reivindicación 17, caracterizado porque la cuantificación se realizada midiendo la densitometría del soporte de electroforesis, después de la coloración de las fracciones de la 10 ALP mediante un sustrato de la ALP.

19. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 18, para la detección de la presencia anormal de una o varias isoenzimas de la ALP.

20. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 19, para el diagnóstico in vitro de una patología hepática o biliar.

21. Procedimiento de separación por electroforesis según las reivindicaciones 1 a 19, para el diagnóstico in vitro de una patología ósea. 20