Separación de células usando un microcanal que tiene pilares con una configuración.

Un aparato de microflujo que comprende:

un cuerpo (11) que tiene una trayectoria de flujo que comprende un medio de entrada (15),

un medio de salida(19) y un microcanal (13), que tiene una región de recogida (17) que se extiende entre dichos medios deentrada y de salida,

en el que dicha región de recogida (17) incluye una pluralidad de pilares verticales (23) sustancialmenteperpendiculares a una superficie de base (22) y alineados transversales a la trayectoria de flujo y dispuestos enuna configuración de matriz irregular y aleatoria por toda la anchura de la región de recogida de modo que nopueda haber ningún flujo en línea recta a través de la región de recogida y que corrientes de flujo directo seanalteradas, constituyendo los pilares una pieza integral con la superficie de base (22) de dicho microcanal yproyectándose desde éste,

en el que el volumen total de dichos pilares es del 15 % al 25 % del volumen total de dicha región de recogida(17).

Separación de células usando un microcanal que tiene pilares con una configuración Esta invención se refiere a la separación o el aislamiento de biomoléculas diana de líquidos de suministro y, más particularmente, a métodos y aparatos para separar células humanas diana deseadas de fluidos corporales o similares.

Antecedentes de la invención

El aislamiento y la recogida efectivos de células raras de una población de células heterogéneas sigue siendo de interés, debido a la creciente demanda de poblaciones de células aisladas para su uso en diagnóstico y tratamiento de enfermedades, por ejemplo terapia génica, así como para investigación científica básica. Por ejemplo, células con cambios patológicos, tales como células cancerosas, pueden separarse de una población de células normales más grande y las poblaciones de células limpiadas pueden transplantarse a continuación de vuelta al paciente.

La separación de células es un área de desarrollo biomédico y clínico que crece rápidamente, y métodos mejorados de separación de un subconjunto de células deseadas de una población compleja permitirá un estudio y un uso más amplios de células que tienen características relativamente uniformes y definidas. La separación de células también se usa ampliamente en investigación, por ejemplo para determinar el efecto de un fármaco o tratamiento sobre una población de células diana, para investigar rutas biológicas, para aislar y estudiar poblaciones de células transformadas o modificadas de otro modo; etc. Los presentes usos clínicos incluyen, por ejemplo, el aislamiento de células madre hematopoyéticas para la reconstitución de células sanguíneas, particularmente en combinación con quimio- y radioterapia ablativa.

La Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada Nº 2004/038315 une adaptadores liberables a las superficies luminales interiores de tubos capilares, con las células unidas deseadas siendo posteriormente liberadas mediante un reactivo de escisión y recuperadas. La Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada Nº 2002/132316 usa dispositivos de microcanal para separar poblaciones de células a través del uso de un campo de gradiente óptico en movimiento. La Patente de Estados Unidos Nº 6.074.827 desvela el uso de dispositivos microfluídicos que están construidos para tener “canales de enriquecimiento” en los que se usa electroforesis para separar e identificar ácidos nucleicos particulares a partir de muestras. También se menciona el uso opcional de antibióticos u otros fragmentos de unión para retener a un biomaterial diana deseado. La Patente de Estados Unidos Nº 6.432.630 desvela un sistema de microflujo para guiar el flujo de un fluido que contiene biopartículas a través de canales donde se empela desvío selectivo, e indica que dichos sistemas pueden usarse para separar células fetales de muestras de sangre materna.

La Patente de Estados Unidos Nº 6.454.924 desvela dispositivos microfluídicos en los que se hace que líquidos que contienen analitos fluyan generalmente hacia abajo pasadas superficies de muestra dispuestas encima de pilares verticales sobre los que están unidos agentes de captura, con las superficies laterales de dichos pilares habiéndose convertido en hidrófobas para facilitar el flujo en los canales que definen.

K. Takahashi et al., J. Nanobiotechnology, 2, 5 (13 de junio de 2004) (6 págs) desvelan sistemas de clasificación de células incorporadas en chip en los que múltiples pasajes de entrada microfluídicos conducen a una región central de clasificación de células con forma de una placa de PDMS (hecha en un molde matriz creado en una resina epoxi fotosensible) que está unida a una placa de vidrio. Electrodos de gel de agar están provistos en la placa de PDMS que facilitan la separación de células no deseadas mediante la aplicación de fuerzas electroestáticas que dirigen estas células al interior de una corriente de desechos continua paralela de tampón, durante su flujo a través de una corta región de confluencia de clasificación de células. Un pre-filtro que usa pilares para atrapar físicamente grandes partículas de polvo también se conoce. La Solicitud Internacional Publicada WO 2004/029221 desvela un dispositivo microfluídico construido de forma similar, que puede usarse para la separación de células, tal como separar eritrocitos fetales de la sangre materna mediante lisis selectiva de eritrocitos maternos. Una muestra que contiene células puede introducirse en un dispositivo de canal microfluídico que separa células completas; éste contiene una pluralidad de obstáculos cilíndricos, con las superficies de los obstáculos teniendo restos de unión, por ejemplo, anticuerpos, acoplados adecuadamente a ellos, restos que se unirán a células en la muestra. La Patente de Estados Unidos Nº 5.637.469 desvela dispositivos microfluídicos que tienen una pluralidad de canales de una profundidad de 100 micrómetros o menos en los que restos de unión, tales como anticuerpos, están inmovilizados sobre superficies para capturar biomoléculas de interés que pueden ser analizadas in situ. La Patente de Estados Unidos Nº

5.147.607 enseña el uso de dispositivos para llevar a cabo inmunoensayos, tales como ensayos en sándwich, donde anticuerpos se movilizan en microcanales. Puede estar provista una zona ahuecada en el microcanal que contiene un grupo de protuberancias que se extienden hacia arriba desde la superficie inferior del canal y en las que están inmovilizados los anticuerpos.

Las anteriores referencias, brevemente descritas, proporcionan pruebas de que existe una búsqueda continua de métodos de separación mejorados para aislar células u otros biomateriales de fluidos corporales o similares. El documento US 6.368.871 desvela un aparato y un método para la manipulación de materiales, incluyendo

partículas, células, macromoléculas, tales como proteínas, ácidos nucleicos y otros restos, en muestras de fluido.

El documento EP 1 371 419 desvela un método y un dispositivo para determinar la presencia o la cantidad de un analito en la muestra de ensayo.

El documento EP 1 413 346 desvela un aparato de separación y un proceso para fabricar un aparato de separación. El aparato de separación tiene una zona de separación de muestras que comprende una serie de huecos definidos en una pared interna de un pasaje de flujo a través del cual pasa una muestra.

Sumario de la invención La invención, en su forma más amplia, se define en las reivindicaciones independientes.

La presente invención proporciona un aparato de microflujo tal como se expone en la reivindicación 1 y un método tal como se expone en la reivindicación 16:

1. Un aparato de microflujo que comprende: un cuerpo (11) que tiene una trayectoria de flujo que comprende un medio de entrada (15) , un medio de salida (19) , y un microcanal (13) que tiene una región de recogida (17) que se extiende entre dichos medios de entrada y de salida, en el que dicha región de recogida (17) incluye una pluralidad de pilares verticales (23) sustancialmente perpendiculares a una superficie de base (22) y alineados transversales a la trayectoria de flujo y dispuestos en una configuración de matriz irregular y aleatoria por toda la anchura de la región de recogida, de modo que no puede haber un flujo en línea recta a través de la región de recogida y que las corrientes de flujo directo son alteradas, constituyendo los pilares una pieza con la superficie de base (22) de dicho microcanal y proyectándose desde ésta, en el que el volumen total de dichos pilares es del 15 % al 25 % del volumen total de dicha región de recogida (17) .

16. Un método de captura de una molécula diana en una muestra que comprende hacer que una masa de líquido que contiene dicha muestra fluya a través de dicho microcanal (13) del aparato de la reivindicación 1, en el que la superficie de dicho microcanal está revestida con un agente de secuestro capaz de unirse a la biomolécula diana.

Algunos aspectos de la presente memoria descriptiva se desvelan a continuación:

La presente divulgación desvela un aparato de microflujo para recuperar células raras u otras biomoléculas diana a partir de cantidades relativamente pequeñas de fluidos corporales o similares, que incorpora al menos un dispositivo de microcanal construido especialmente. Dicho dispositivo está construido usando un sustrato que está formado con una trayectoria de flujo similar a un canal que incorpora una pluralidad de pilares fijos transversales en una región de recogida; estos pilares constituyen una pieza con el sustrato y se extienden entre las superficies superior e inferior del canal. Los pilares están dispuestos en una... [Seguir leyendo]

1. Un aparato de microflujo que comprende:

un cuerpo (11) que tiene una trayectoria de flujo que comprende un medio de entrada (15) , un medio de salida (19) y un microcanal (13) , que tiene una región de recogida (17) que se extiende entre dichos medios de entrada y de salida, en el que dicha región de recogida (17) incluye una pluralidad de pilares verticales (23) sustancialmente perpendiculares a una superficie de base (22) y alineados transversales a la trayectoria de flujo y dispuestos en una configuración de matriz irregular y aleatoria por toda la anchura de la región de recogida de modo que no pueda haber ningún flujo en línea recta a través de la región de recogida y que corrientes de flujo directo sean alteradas, constituyendo los pilares una pieza integral con la superficie de base (22) de dicho microcanal y proyectándose desde éste, en el que el volumen total de dichos pilares es del 15 % al 25 % del volumen total de dicha región de recogida (17) .

2. El aparato de la reivindicación 1, en el que dicha configuración aleatoria de pilares (23) comprende pilares de diferentes tamaños de sección.

3. El aparato de la reivindicación 1, en el que dichos pilares (23) tienen de 70 μm a 130 μm de diámetro.

4. El aparato de la reivindicación 1, en el que la distancia mínima entre dos de dichos pilares (23) es de 50 μm a 70 μm.

5. El aparato de la reivindicación 1, en el que el aparato de microflujo está inclinado con respecto a la horizontal.

6. El aparato de la reivindicación 1, en el que el cuerpo (11) tiene una superficie plana (27) y el microcanal (13) está ubicado en una cavidad del cuerpo por debajo de la superficie plana.

7. El aparato de la reivindicación 1, en el que la superficie de dicho microcanal (13) está revestido con una capa de hidrogel permeable hidrófilo.

8. El aparato de la reivindicación 1, en el que la superficie de dicho microcanal (13) está revestida con una capa de hidrogel permeable hidrófilo que comprende un polímero de PEG, PPG con una función de isocianato o un copolímero de los mismos que se polimeriza mediante enlaces uretano y que contiene grupos isocianato reactivos.

9. El aparato de la reivindicación 1, en el que la superficie de dicho microcanal (13) está revestida con un agente de secuestro.

10. El aparato de la reivindicación 1, en el que la superficie de dicho microcanal (13) está revestida con un agente de secuestro seleccionado entre el grupo constituido por ácido nucleico, proteína, receptores, péptidos, enzimas, inhibidores de enzimas, sustratos enzimáticos, inmunoglobulinas, antígenos, lectinas, proteínas modificadas, péptidos modificados, ADN bicatenario, aminas biógenas y carbohidratos complejos.

11. El aparato de la reivindicación 1, en el que un agente de secuestro está acoplado a la superficie de dicho microcanal (13) mediante un adaptador.

12. El aparato de la reivindicación 1, en el que un agente de secuestro es un anticuerpo acoplado a la superficie de dicho microcanal (13) mediante un adaptador hidrófilo o una capa de hidrogel que tiene grupos isocianato libres.

13. El aparato de la reivindicación 1, en el que dicho medio de entrada incluye un pozo de suministro capaz de contener una muestra de líquido.

14. El aparato de la reivindicación 1, en el que dicho microcanal (13) se sella con una placa (27) fijada a los extremos libres de dichos pilares (23) .

15. El aparato de la reivindicación 1, en el que la trayectoria de flujo proporcionada por dichos pilares (23) promueve torbellinos y remolinos.

16. Un método de captura de una molécula diana en una muestra que comprende hacer que una masa de líquido que contiene dicha muestra fluya a través de dicho microcanal (13) del aparato de la reivindicación 1, en el que la superficie de dicho microcanal está revestida con un agente de secuestro capaz de unirse a la biomolécula diana.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la molécula diana es una célula presente en la sangre.

18. El método de la reivindicación 16, en el que la molécula diana es una célula cancerosa metastásica.

19. El método de la reivindicación 16, en el que la molécula diana es una célula fetal de una muestra de sangre materna o un trofoblasto de extracto de moco del cuello uterino.

20. El método de la reivindicación 16, en el que la masa de líquido que contiene dicha muestra fluye a través de dicho microcanal (13) a una velocidad de 0, 2 mm a 1 mm por segundo.