Reactivos y métodos para la hibridación automatizada in situ o para microarray.

Una composición acuosa, que comprende SSPE 4X-8X y sorbitán de polioxietileno al 8-12% (20).

Reactivos y métodos para la hibridación automatizada in situ o para microarray.

La invención está relacionada con los campos de la medicina, la genética, la bioquímica y la biología molecular. En particular, la invención se refiere a reactivos, kits de reactivos, y métodos para la hibridación automatizada. Más particularmente, la invención se refiere a reactivos, kits de reactivos, y los métodos para la hibridación automatizada in situ y la hibridación automatizada en microarrays.

Las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos se pueden utilizar para detectar y caracterizar secuencias de nucleótidos específicas en moléculas de DNA y de ARN. Por ejemplo, la transferencia de Southern implica la extracción de DNA a partir de células o tejidos y puede utilizarse para determinar la estructura genética de un cromosoma particular. De manera similar, la transferencia Northern implica la extracción de RNA a partir de células o tejidos y puede utilizarse para determinar si está presente y cuánta cantidad de un RNAm particular en un determinado tejido. Otros formatos de ensayo para la detección de ácidos nucleicos por hibridación incluyen los siguientes: ensayos de detección de expresión diferencial de genes ("nuclear run-on") ; ensayos de slot blot, separación con partículas magnéticas; ensayos de transferencia de Northern reversos; ensayos de dot blot; ensayos de protección de RNasa, reacción en cadena de ligasa (LCR) , reacción en cadena de polimerasa (PCR) ; PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) ; RT-PCR de visualización diferencial (DDRT-PCR) ; hibridación in situ, y, más recientemente, los arrays microfabricados (también referidos como "microarrays" o "chips de genes") . En cada uno de estos formatos, los métodos de detección que se pueden emplear incluyen, entre otros, marcadores radiactivos, marcadores enzimáticos, marcadores quimioluminiscentes, y marcajes fluorescentes.

La hibridación in situ es una técnica poderosa para, entre otros usos, la identificación de la localización subcelular de los ácidos nucleicos. Dado que los ácidos nucleicos, no menos que otras macromoléculas, ocupan posiciones precisas en células y tejidos, se pierde una gran cantidad de información potencial cuando los ácidos nucleicos se extraen mediante homogeneización. Por esta razón, se han desarrollado técnicas en las que se utilizan sondas de ácidos nucleicos para localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos in situ, un procedimiento llamado hibridación in situ (ISH) . La ISH puede realizarse para analizar el DNA o RNA en las células.

En el análisis de ISH de DNA, se hibridan las sondas de ácidos nucleicos marcadas a cromosomas que han sido expuestos brevemente a un pH muy alto o alta temperatura para romper sus pares de bases de DNA. Las regiones cromosómicas que se unen a la sonda durante el paso de hibridación se visualizan entonces. Originalmente, esta técnica fue desarrollada utilizando sondas de DNA altamente radiactivas, que se detectaban mediante autorradiografía. La resolución espacial de la técnica, sin embargo, puede mejorarse enormemente mediante el etiquetado químico de las sondas de DNA en lugar de radiactivamente. Para este fin, las sondas se sintetizan con nucleótidos especiales que contienen una cadena lateral modificada, y las sondas hibridadas se detectan con un anticuerpo (u otro ligando) que reconoce específicamente esta cadena lateral.

Los métodos de hibridación de RNA in situ puede revelar la distribución de moléculas específicas de RNA en las células y tejidos. En este caso, los tejidos no están expuestos a un pH o temperatura alta, de modo que el DNA cromosómico se mantiene en forma de doble cadena y no se puede unir la sonda. Si en lugar de esto, el tejido se fija, el RNA se conserva en una forma expuesta capaz de hibridar con una sonda de DNA o RNA complementario. De esta manera, los patrones de expresión génica diferencial pueden observarse en los tejidos.

La hibridación in situ de RNAm es útil para estudiar la enfermedad, identificar posibles dianas terapéuticas y evaluar los fármacos candidatos. Por ejemplo, el diagnóstico de cáncer de mama, de ovario y otros carcinomas puede ser facilitado por técnicas que determinan la presencia y expresión del protooncogén c-erb2/HER-2/neu. El protooncogén c-erb2/HER-2/neu es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de receptoras tirosina quinasas. La amplificación y la sobreexpresión del protooncogén c-erb2/HER-2/neu se encuentra en aproximadamente el 30% de los carcinomas de mama y aproximadamente el 20% de los carcinomas de ovario. Andrecheck et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3444.

Pueden utilizarse sondas de DNA o RNA para la hibridación in situ. Normalmente, una sonda de RNA ("ribosonda") se realiza mediante transcripción in vitro de un DNAc clonado que codifica el gen de interés. Por lo tanto, se debe tener un vector que contiene el DNAc flanqueado por promotores, tales como promotores T7 y T3, con el fin de hacer una ribosonda. Por otro lado, una sonda de oligonucleótido de DNA ("oligosonda") se puede preparar, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado de DNA. Por lo tanto, un experto en la materia sólo necesita conocer la secuencia del gen de interés para hacer una oligosonda. Una ventaja adicional de oligosondas para la hibridación in situ es que son más estables que las ribosondas. Una ventaja adicional de las oligosondas es que, debido a su corta longitud, puede facilitarse el acceso y la hibridación con una diana. Además de las oligosondas y las ribosondas, pueden utilizarse para la hibridación in situ sondas híbridas de DNA / RNA (es decir, aquellas que contienen ambos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos) y sondas que contienen ácidos nucleicos modificados.

Se han desarrollado recientemente instrumentos para la automatización de la hibridación in situ. Por ejemplo, véase la patente de EE.UU. N º 6.296.809, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Tales instrumentos son programables y capaces de realizar la hibridación in situ en muestras múltiples de manera que cada muestra está sujeta a su propia tinción y protocolo de tratamiento, incluso cuando cada muestra requiere sus propios parámetros de temperatura. Además, las muestras que requieren desparafinado (por ejemplo, las secciones del tumor) pueden procesarse de forma automática al mismo tiempo que otras muestras que no requieren esta etapa preliminar (por ejemplo, frotis) . Por lo tanto, los instrumentos automatizados reducen drásticamente la mano de obra y el tiempo implicados en la hibridación in situ, y también facilitan la estandarización de los protocolos y la consistencia entre los resultados.

Los microarrays son matrices de muchos ácidos nucleicos que tienen secuencias diferentes, impresas en posiciones específicas en un área pequeña en un sustrato tal como un portaobjetos de vidrio. La hibridación en un microarray ("hibridación de microarrays") es una técnica poderosa para, entre otros usos, determinar simultáneamente los niveles de expresión de muchos genes diferentes en una célula o muestra de tejido. Por ejemplo, Schena et al. (1996) utilizaron microarrays para monitorizar cuantitativamente la expresión diferencial los genes regulados por proteínas de choque térmico y de éster de forbol en las células T humanas. Schena et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 10614. Del mismo modo, Heller et al. (1997) demostraron el uso de chips de genes para el perfil de expresión de determinados genes humanos implicados en la inflamación, así como los genes expresados en las células de sangre periférica humanas. Heller et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:2150.

Además, las matrices de sondas de oligonucleótidos inmovilizadas sobre soportes sólidos se han utilizado para determinar las secuencias específicas de ácido nucleico en un ácido nucleico diana. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 5.202.231 y 5.002.867, así como la Publicación Internacional Nº WO 93/17126, se refiere a la utilización de un gran número de sondas de oligonucleótidos para proporcionar la secuencia completa de ácido nucleico de una molécula de ácido nucleico diana.

Los métodos adicionales de la utilización de microarrays se describen en las siguientes patentes de EE.UU., cada una de las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Southern (Patentes de EE.UU. Nos. 5.700.637 y 6.054.270) describe un aparato y un método para analizar una secuencia de polinucleótidos con el fin de realizar estudios de polimorfismo de genes, análisis de huellas digitales genómico, análisis de ligamiento, caracterización de RNAm, estudios de expresión génica, y determinaciones de la secuencia.... [Seguir leyendo]

1. Una composición acuosa, que comprende SSP.

4. 8X y sorbitán de polioxietileno al 8-12% (20) .

2. La composición de la reivindicación 1, que comprende SSPE 6X y sorbitán de polioxietileno al 10% (20) .

3. Una composición acuosa que comprende tampón fosfato con una concentración total de sal de 10-200 mM, gammaglobulinas de cabra al 0, 5-6%, caseína hidrolizada al 5-15% y detergente no iónico al 0, 005-1%.

4. La composición de la reivindicación 3, que comprende fosfato de potasio 75 mM, fosfato de sodio 25 mM, NaCl 55 mM, gamma-globulinas de cabra al 3%, caseína hidrolizada al 13, 4%, y 0, 05% de lauril éter de polioxietileno (23) .

5. Un kit de reactivos para utilizar en la hibridación automatizada de microarrays, que comprende:

(a) una composición acuosa, que comprende SSP.

4. 8X y sorbitán de polioxietileno al 8-12% (20) ;

(b) una composición acuosa, que comprende tampón fosfato con una concentración total de sal de 10-200 mM, gammaglobulinas de cabra al 0, 5-6%, caseína hidrolizada al 5-15%, y detergente no iónico al 0, 005-1%,

(c) una composición acuosa, que comprende SSPE 2-6X, sal de sodio de sulfato de dextrano 17, 5-22, 5% peso molecular promedio de 10000, y formamida al 10-50%, y

(d) una composición acuosa, que comprende detergente de limpieza de microarrays al 0, 1-5%, que comprende tensioactivos aniónicos y no iónicos biodegradables, sin fosfato.

6. El kit de reactivos de la reivindicación 5, que comprende:

(a) una composición acuosa, que comprende SSPE 6X y sorbitán de polioxietileno al 10% (20) ;

(b) una composición acuosa, que comprende fosfato de potasio 75 mM, fosfato de sodio 25 mM, NaCl 55 mM, gamma globulinas de cabra al 3%, caseína hidrolizada al 13, 4% y detergente de bloqueo al 0, 05%;

(c) una composición acuosa, que comprende SSPE 6X, sal sódico de sulfato de dextrano al 20%, peso molecular promedio de 10000, y formamida al 10%, y

(d) una composición acuosa, que comprende detergente de limpieza de microarrays al 1%.

7. Un método automatizado para la hibridación in situ, que comprende:

(a) exponer una muestra de tejidos o de células o una solución de prehibridación que incluye una solución de prehibridación primaria acuosa que comprende cloruro sódico al 0, 15-1, 5 M, fosfato de sodio dibásico 8-80 mM, fosfato de sodio monobásico 2-20 mM, EDTA 1-10 mM, condensado de óxido de etileno octilfenol al 0, 0125-0, 125%, lauril éter de polioxietileno al 0, 00375-0, 0375% (23) , y formalina al 10-40%, y una solución de prehibridación secundaria que comprende HCl 0, 3 N;

(b) exponer la muestra a un reactivo de acondicionamiento celular que comprende citrato sódico al 0, 4-8, 2 mM, ácido cítrico 1, 8-10 mM, conservante de acondicionamiento celular al 0, 1-1%, que comprende además 5-cloro-2metil-4-isotiazolin-3-ona, 2-metil-4-isotiazolin-3-ona, glicol modificado, y carboxilato de alquilo, y detergente de acondicionamiento celular al 0, 05-5%, que comprende además sorbitán de polioxietileno (20) ;

(c) exponer la muestra a una sonda de ácido nucleico en una solución de hibridación, la solución de hibridación incluye una solución de hibridación in situ que comprende SSPE 2X, sal sódica de sulfato de dextrano al 20%, peso molecular promedio 10000, formamida al 80%, y detergente no iónico al 0, 05% que comprende lauril éter de polioxietileno (23) , o una solución de hibridación de microarrays que comprende SSPE 6X, sal sódica de sulfato de dextrano al 20%, peso molecular promedio 10000, formamida al 10%;

(d) exponer la muestra a una solución de lavado que comprende cloruro sódico al 0, 1-0, 5 M, fosfato dibásico 5-30 mM, fosfato de sodio monobásico 1-10 mM, EDTA 0, 5-5 mM y un primer detergente no iónico al 0, 01-0, 1% y un segundo detergente no iónico al 0, 0025-0, 025% ;

(e) exponer la muestra a una solución de fijación post-hibridación que comprende cloruro sódico al 0, 15-1, 5 M, fosfato de sodio dibásico 8-80 mM, fosfato de sodio monobásico 2-20 mM, EDTA 1-10 mM, condensado de óxido de etileno octilfenol al 0, 0125-0, 125%, lauril éter de polioxietileno al 0, 00375-0, 0375% (23) y formalina al 10-40%, y.

(f) analizar la muestra para la hibridación entre la sonda y un ácido nucleico diana; en el que los pasos (a) - (e) se realizan utilizando un instrumento automatizado.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la primera solución de prehibridación comprende cloruro de sodio 0, 3 M, fosfato de sodio dibásico 16 mM, fosfato de sodio monobásico 4 mM, EDTA 2 mM; condensado de óxido de

etileno octofenol al 0, 025%, lauril éter de polioxietileno (23) al 0, 0075% y formalina al 30%.

9. El método de la reivindicación 7, en el que el reactivo de acondicionamiento celular comprende citrato sódico al 8, 2 mM, ácido cítrico al 1, 8 mM, conservante de acondicionamiento celular al 0, 05%, que comprende además 5cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona, 2-metil-4-isotiazolin-3-ona, glicol modificado, y carboxilato de alquilo, y detergente de acondicionamiento celular al 0, 1%, que comprende además sorbitán de polioxietileno (20) .

10. El método de la reivindicación 7, en el que la solución de lavado comprende cloruro de sodio 0, 3 M, fosfato de sodio dibásico 16 mM, fosfato de sodio monobásico 4 mM, EDTA 2 mM, primer detergente no iónico 0, 025%, y segundo detergente no iónico 0, 0075%.

11. El método de la reivindicación 7, en el que la solución de fijación post-hibridación comprende cloruro de sodio 0, 3 M, fosfato de sodio dibásico 16 mM, fosfato de sodio monobásico 4 mM, EDTA 2 mM, condensado de óxido de etileno octofenol al 0, 025%, lauril éter de polioxietileno al 0, 0075% (23) , y formalina al 30%.

12. El método de la reivindicación 7, que comprende:

(a) exponer una muestra de tejido o celular a la composición que comprende cloruro de sodio 0, 3 M, fosfato de sodio dibásico 16 mM, fosfato de sodio monobásico 4 mM, EDTA 2 mM, condensado de óxido de etileno de octilfenol 0, 025%, y lauril éter de polioxietileno al 0, 0075% (23) , y formalina al 30%;

(b) exponer la muestra a una composición que comprende HCl 0, 3 N;

(c) exponer la muestra a una composición que comprende citrato sódico 8, 2 mM, ácido cítrico 1, 8 mM, conservante de acondicionamiento celular al 0, 05%, que comprende además de 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona, 2-metil-4isotiazolin-3-ona, glicol modificado, y carboxilato de alquilo, y detergente de acondicionamiento celular al 0, 1%, que comprende adicionalmente. sorbitán de polioxietileno (20) ,

(d) exponer la muestra a una sonda de ácido nucleico en una composición que comprende SSPE 2X, sal sódico de sulfato de dextrano al 20%, peso molecular promedio 10000, formamida al 80%, y detergente no iónico al 0, 05% que comprende lauril éter de polioxietileno (23) ;

(e) exponer la muestra a una composición que comprende cloruro de sodio 0, 3 M, fosfato de sodio dibásico 16 mM, fosfato de sodio monobásico 4 mM, EDTA 2 mM, condensado de óxido de etileno octofenol al 0, 025%, lauril éter de polioxietileno al 0, 0075% (23) , y formalina al 30%, y un segundo detergente de lavado no iónico al 0, 0075%;

(f) exponer la muestra a una composición que comprende cloruro de sodio 0, 3 M, fosfato de sodio dibásico 16 mM, fosfato de sodio monobásico 4 mM, EDTA 2 mM; condensado de óxido de etileno octofenol al 0, 025%, lauril éter de polioxietileno al 0, 0075% (23) y formalina al 30%, y

(g) analizar la muestra para la hibridación entre la sonda y un ácido nucleico diana; en el que los pasos (a) - (f) se realizan usando un instrumento automatizado.

13. Un método para la hibridación automatizada de microarrays, que comprende:

(a) exponer un microarray a una solución de potenciador de la propagación que comprende SSP.

4. 8X y sorbitán de polioxietileno al 8-12% (20) ;

(b) exponer el microarray a una solución de bloqueo que comprende tampón de fosfato con concentración de sal total de 10-200 mM, gammaglobulinas de cabra al 0, 5-6%, caseína hidrolizada al 5-15%, y detergente no iónico al 0, 005-1%,

(c) exponer el microarray a un ácido nucleico diana en una solución de hibridación que incluye una solución de hibridación in situ que comprende SSPE 2X, sal sódica de sulfato de dextrano al 20%, peso molecular promedio de 10.000, formamida al 80%, y detergente no iónico al 0, 05%, o una solución de hibridación de microarrays que comprende SSPE 6X, sal sódica de sulfato de dextrano al 20%, peso molecular promedio de 10.000, y formamida al 10 %,

(d) exponer el microarrays a una solución de lavado que comprende cloruro sódico 0, 1-0, 5 M, fosfato de sodio dibásico 5-30 mM, fosfato de sodio monobásico 1-10 mM, EDTA 0, 5-5 mM, un primer detergente no iónico al 0, 010, 1% y un segundo detergente no iónico al 0, 0025-0, 025%;

(e) exponer el microarray a una solución de limpieza de microarray que comprende agua y tensioactivos aniónicos y no iónicos biodegradables, sin fosfato al 0, 1-5%, y

(f) analizar el microarray para hibridación entre una sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico diana; en el que los pasos (a) , (b) , (d) y (e) se realizan utilizando un instrumento automatizado.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la solución potenciadora de la propagación es la composición de la

reivindicación 2.

15. El método de la reivindicación 13, en el que la solución de lavado comprende cloruro de sodio 0, 3 M, fosfato de sodio dibásico 16 mM, fosfato de sodio monobásico 4 mM, EDTA 2 mM, primer detergente no iónico al 0, 025%, y segundo detergente no iónico al 0, 0075%.

16. El método de la reivindicación 13, en el que la solución de limpieza de microarrays comprende tensioactivos aniónicos y no iónicos biodegradables, sin fosfato al 1%.

17. El método de la reivindicación 13, que comprende:

(a) exponer un microarray para la composición de la reivindicación;

(b) exponer la microarray a una composición que comprende fosfato de potasio 75 mM, fosfato de sodio 25 mM,

NaCl 55 mM, gamma-globulinas de cabra al 3%, caseína hidrolizada al 13, 4%, y lauril éter de polioxietileno al 0, 05% (23) ;

(c) exponer el microarray a un ácido nucleico diana en una solución de hibridación que incluye una solución de hibridación in situ que comprende SSPE 2X, sal sódica de sulfato de dextrano al 20%, peso molecular promedio de 10.000, formamida al 80%, y detergente no iónico al 0, 05%, o una solución de hibridación de microarrays que comprende SSPE 6X; sal sódica de sulfato de dextrano al 20%, peso molecular promedio de 10.000, y formamida al 10%,

(d) exponer el microarray a una composición que comprende cloruro de sodio 0, 3 M, fosfato de sodio dibásico 16 mM, fosfato de sodio monobásico 4 mM, EDTA 2 mM, primer detergente no iónico al 0, 025%, y segundo detergente no iónico al 0, 0075%;

(e) exponer el microarray a una composición que comprende tensioactivos aniónicos y no iónicos biodegradables, sin fosfato al 1%, y

(f) analizar el microarray para la hibridación entre una sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico diana; en el que los pasos (a) , (b) , (d) y (e) se realizan utilizando un instrumento automatizado.

Hibridación in situ utilizando oligosondas

Fig. 1

FIGURA 2

Comparación de las técnicas de hibridación manual y con DISCOVERYTM (señal vs ruido de fondo)