Proteínas y genes del virus del Nilo occidental y del dengue y su aplicación terapéutica.

Virus recombinante que es un virus vivo atenuado o defectuoso del sarampión,

que comprende un polinucleótidoque codifica un polipéptido que es un virus del Nilo occidental o respectivamente un antígeno del 5 virus del dengueque se selecciona en el grupo siguiente:

- las glucoproteínas heterodímeras Prem-E o

- una glucoproteína de la envoltura segregada sE o

- un polipéptido que tiene al menos un 80% de homología, o un 85% de homología con el polipéptido que tiene lasecuencia SEC. ID. nº 6, SEC. ID. nº 5 o SEC. ID. nº 8,

siendo dicho virus recombinante capaz de expresar dicho polipéptido y siendo dicho polipéptido capaz de inducir unarespuesta inmunitaria protectora contra un virus del Nilo occidental en un animal o, respectivamente, contra un virusdel dengue en un animal.

Proteínas y genes del virus del Nilo occidental y del dengue y su aplicación terapéutica.

Campo de la invención La solicitud describe el virus del Nilo occidental (VNO) y/o péptidos procedentes del virus del dengue, y más especialmente polipéptidos o polinucleótidos procedentes de VNO y/o polipéptidos o polinucleótidos del virus del dengue y su utilización en la preparación de composiciones y vacunas. La presente invención se refiere a composiciones, vacunas y procedimientos para proporcionar una respuesta inmunitaria y/o una inmunidad protectora frente a los animales contra un virus del Nilo occidental o un virus del dengue.

Antecedentes de la invención Flaviviridae son arbovirus (virus transmitidos por artrópodos) transportados principalmente por mosquitos y garrapatas que chupan sangre. Son pequeños virus encapsulados y sus genomas están constituidos por ARN monocatenario y lineal infeccioso de polaridad positiva. En el hombre, los flavivirus ocasionan fiebre hemorrágica mortal o meningoencefalitis. La fiebre amarilla, la fiebre del dengue y la encefalitis japonesa son los principales flavivirosis tropicales. Otras importantes flaviviroses humanas son la encefalitis de Saint Louis, la encefalitis europea transmitida por garrapatas y la fiebre del Nilo occidental.

La fiebre del Nilo occidental es una zoonosis asociada a un flavivirus que fue aislada por primera vez en Uganda en 1937. Su ciclo de transmisión requiere aves como principal reservorio y mosquitos chupadores de sangre del género Culex como vectores. Las aves migratorias virémicas transportan el virus a regiones lejanas donde lo transmiten de nuevo a los mosquitos ornitófilos del género Culex. Muchas especies de mamíferos son tolerantes para el virus del Nilo occidental. Los caballos son particularmente sensibles a la enfermedad pero no participan en el ciclo detransmisión. La fiebre del Nilo occidental es endémica en África, Asia, Europa y Australia. Estudios filogenéticos han puesto de manifiesto la existencia de dos cepas de virus: La estirpe 1 del virus tiene una distribución mundial, y la estirpe 2 del virus es esencialmente africana. La estirpe 1 del virus fue responsable de enzootias en Rumanía (1996) , Rusia (1999) , Israel (1998-2000) y más recientemente en América del Norte donde el virus nunca se había detectado antes de 1999. Las cepas víricas aisladas durante las recientes epidemias en Israel y Estados Unidos, son más de 99, 7% idénticas. En el Medio Oriente y América del Norte, donde ha arraigado el virus, se ha observado una tasa importante de mortalidad de aves entre las aves infectadas, especialmente en Corvidae. En América del Norte, más de 4.000 sujetos fueron infectados con el virus del Nilo occidental, de las cuales 250 murieron entre los meses de agosto y diciembre de 2002. En la actualidad, se observa zoonosis en todas las regiones de los Estados Unidos. Por el momento, no existe una vacuna humana o terapia específica contra la fiebre del Nilo occidental.

En las regiones templadas y subtropicales, las infecciones humanas pueden ocurrir durante la temporada de otoño. Cuando un mosquito infectado pica a un sujeto, el período de incubación dura aproximadamente una semana, pero menos del 20% de las personas infectadas con el virus del Nilo occidental nunca siguen manifestaciones clínicas. En su forma benigna, la infección vírica se manifiesta por un estado febril indiferenciado asociado a debilidad muscular, dolores de cabeza y dolor abdominal. En menos de 1% de las personas infectadas, puede ocurrir meningitis o encefalitis aséptica aguda. También se observan esplenomegalia, hepatitis, pancreatitis y miocarditis. La parálisis de matraz similar a un síndrome poliomielítico se ha descrito recientemente, pero los casos mortales de encefalitis vírica (5% de los pacientes con graves trastornos neurológicos) se refieren principalmente a personas débiles y ancianos. La transmisión interhumana del virus también se ha observado recientemente en los Estados Unidos en personas que han recibido trasplantes de órganos o que han sido perfundidas con productos sanguíneos contaminados. La transmisión intrauterina del virus se ha descrito en Estados Unidos. El desarrollo de una vacuna humana contra la fiebre del Nilo occidental es una prioridad en vista del hecho de que la zoonosis ha arraigado en América del Norte y es de esperar que se propague en los próximos meses a América Central, América del Sur y el Caribe, donde ya proliferan la fiebre del dengue y la fiebre amarilla.

Por lo tanto, hay una necesidad de péptidos procedentes del virus del Nilo occidental (VNO) y/o del virus del dengue, y más concretamente de polipéptidos o polinucleótidos procedentes de VNO y/o de polipéptidos o polinucleótidos del virus del dengue y su utilización en la preparación de composiciones y vacunas.

La presente invención satisface estas necesidades y también otras necesidades que serán evidentes para los expertos en la técnica al leer la siguiente memoria.

Davis B. et al. (Journal of Virology, mayo de 2001, págs. 4040-4047) da a conocer un plásmido de expresión recombinante que expresa las proteínas pre-S y E de una cepa de virus del Nilo occidental. Según esta publicación, una sola inyección intramuscular del vector provocó inmunidad protectora en ratones y caballos.

La solicitud de patente internacional WO 90/01946 describe virus de vacunas que expresan proteínas antigénicas de flavivirus, en especial proteínas antigénicas de un virus tipo 4 del dengue, un virus de la encefalitis B japonesa o de la encefalitis transmitida por garrapatas. En concreto, describe virus de vacunas que contienen una secuencia de codificación para la membrana de la cápside y antígenos de la envoltura del virus del dengue, que expresan los antígenos correspondientes y la protección permitida de ratones inmunizados.

Wang Z. et al. (Vaccine 19 (2001) ) describe virus recombinantes de sarampión que expresan el HN las glucoproteínas de superficie F de virus del sarampión o las proteínas ENV, GAG o POL del virus de la inmunodeficiencia de simios.

La solicitud de patente internacional WO 2004/001051 con fecha de presentación 30 de junio de 2003, da a conocer el virus recombinante de sarampión que expresa la envoltura o el antígeno pre-M del virus del Nilo occidental. Se da a conocer el polipéptido segregado de la envoltura del virus del Nilo occidental, pero lo da a conocer e este sentido no se beneficia de la fecha de prioridad de dicha solicitud de patente internacional.

Fonseca B. et al. (1994 Vaccine vol. 12 nº 3) describe virus recombinantes de vacunas que coexpresan glucoproteínas pre-M y E del dengue 1. La publicación dice que los virus obtenidos de este modo provocaron la producción de anticuerpos neutralizantes en ratones inoculados con los virus recombinantes.

Sumario de la invención La solicitud da a conocer polipéptidos procedentes del virus del Nilo occidental y/o del virus del dengue, y un polipéptido purificado que procede de un antígeno del virus del Nilo occidental o de un antígeno del virus del dengue.

La solicitud describe un anticuerpo purificado policlonal o monoclonal, capaz de unirse específicamente a un polipéptido dado a conocer.

La solicitud da a conocer una secuencia de polinucleótido purificado que codifica el polipéptido dado a conocer y su utilización para detectar la presencia o ausencia de un antígeno del virus del Nilo occidental o un antígeno del virus del dengue en una muestra biológica.

La invención se refiere a un vector vírico recombinante que es un virus recombinante del sarampión que comprende una secuencia de polinucleótidos dada a conocer.

Un objetivo de la invención es un virus recombinante del sarampión capaz de expresar un polipéptido de la invención o que comprende, en su genoma, un polinucleótido dado a conocer.

Aún, otro objeto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende:

a) al menos un componente seleccionado del grupo que consta de:

- un virus recombinante del sarampión de la invención, y

b) un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

Otro objetivo de la invención se refiere al uso de la composición farmacéutica de la invención, como un agente antivirus del Nilo occidental y/o de un antivirus del dengue, o para la preparación de un antivirus del Nilo occidental y/o de una vacuna antivirus del dengue.

Otro objetivo de la invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un vector vírico recombinante como se define anteriormente.

Además, otro objetivo de la invención se refiere a un procedimiento de producción de un virus recombinante para la preparación de una vacuna... [Seguir leyendo]

1. Virus recombinante que es un virus vivo atenuado o defectuoso del sarampión, que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que es un virus del Nilo occidental o respectivamente un antígeno del virus del dengue que se selecciona en el grupo siguiente:

-las glucoproteínas heterodímeras Prem-E o.

10. una glucoproteína de la envoltura segregada sE o

-un polipéptido que tiene al menos un 80% de homología, o un 85% de homología con el polipéptido que tiene la secuencia SEC. ID. nº 6, SEC. ID. nº 5 o SEC. ID. nº 8,

siendo dicho virus recombinante capaz de expresar dicho polipéptido y siendo dicho polipéptido capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora contra un virus del Nilo occidental en un animal o, respectivamente, contra un virus del dengue en un animal.

2. Virus recombinante según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido seleccionado en el 20 grupo siguiente:

-la glucoproteína heterodímero Prem-E que comprende la secuencia SEC. ID. nº 6 o SEC. ID. nº 8 o tiene la secuencia SEC. ID. nº 6 o SEC. ID. nº 8.

- la proteína sE de la envoltura segregada que tiene la secuencia SEC. ID. nº 5.

3. Virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho polinucleótido comprende la secuencia SEC. ID. nº 2 o es la secuencia SEQ 10 nº 1 o que comprende la secuencia SEC. ID. nº 4.

4. Virus recombinante de sarampión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende, en su genoma, dicho polinucleótido.

5. Virus recombinante de sarampión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que procede de la cepa Schwarz del virus del sarampión. 35

6. Composición farmacéutica, que comprende:

a) por lo menos un virus recombinante del sarampión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y 40 b) un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, capaz de inducir una inmunidad protectora contra un virus del Nilo occidental en un animal o, respectivamente, de inducir una inmunidad protectora contra el virus del dengue, en un animal.

8. Utilización de una composición farmacéutica según la reivindicación 7, como agente contra el virus del Nilo occidental o, respectivamente, un agente contra el virus del dengue, o para la preparación de una vacuna contra el virus del Nilo occidental o, respectivamente, una vacuna contra el virus del dengue.

9. Célula hospedadora, que comprende un virus recombinante tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Procedimiento de producción de un virus recombinante para la preparación de una vacuna contra el virus del Nilo occidental, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:

a) proporcionar una célula hospedadora tal como se define en la reivindicación 9;

b) colocar la célula hospedadora de la etapa a) en condiciones que permitan la replicación de un virus recombinante tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es capaz de expresar dicho 60 polipéptido, y

c) aislar el virus recombinante producido en la etapa b) .

11. Célula hospedadora según la reivindicación 9, que es la estirpe celular depositada en la C.N.C.M. con el número 65 de entrada I-3018.

12. Utilización de una cantidad eficaz de al menos un virus recombinante de sarampión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y/o a la prevención de una infección por el virus del Nilo occidental o una infección por el virus del dengue, en un animal.