Proteínas HLA-G y usos farmacéuticos de las mismas.

Un polipéptido de fusión que comprende (i) un primer polipéptido que comprende la secuencia de un dominiode un antígeno HLA-G unida a (ii) un segundo polipéptido que comprende la secuencia de un dominio Fc de unainmunoglobulina y que carece de un sitio de unión al antígeno funcional de la inmunoglobulina.

Proteínas HLA-G y usos farmacéuticos de las mismas La presente invención se refiere a proteínas nuevas y a los usos farmacéuticos de las mismas. La invención se refiere de manera más específica a proteínas de fusión nuevas que comprenden un dominio de un antígeno HLA-G fusionado a un dominio Fc de una inmunoglobulina. La invención se refiere además a métodos para producir tales polipéptidos, a las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos, así como a sus usos para tratar diversas enfermedades que incluyen el rechazo de órganos/tejidos.

Antecedentes Los antígenos del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) se dividen en tres clases principales, concretamente los antígenos de clase I, antígenos de clase II (HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR) , y antígenos de clase III.

Los antígenos de clase I comprenden los antígenos convencionales, HLA-A, HLA-B y HLA-C, que exhiben 3 dominios globulares ([alfa]1, [alfa]2 y [alfa]3) , así como los antígenos no convencionales HLA-E, HLA-F, y HLA-G.

HLA-G es una molécula de Clase I de HLA no clásica expresada por los trofoblastos extravellosos de placenta humana normal y las células epiteliales del timo. Los antígenos HLA-G se expresan básicamente en las células citotrofoblásticas de la placenta, y funcionan como agentes inmunomoduladores que protegen al feto del sistema inmunitario materno (ausencia de rechazo por parte de la madre) . Se ha descrito la secuencia del gen de HLA-G (p.ej., Geraghty et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84, 9145-9149; Ellis; et al., J. Immunol., 1990, 144, 731-735) , y comprende 4396 pares de bases. Este gen está compuesto de 8 exones, 7 intrones y un extremo 3' sin traducir, que corresponden respectivamente a los dominios siguientes: exón 1: secuencia señal, exón 2: dominio extracelular alfa1, exón 3: dominio extracelular alfa2, exón 4: dominio extracelular alfa3, exón 5: región transmembrana, exón 6: dominio citoplasmático I, exón 7: dominio citoplasmático II (sin traducir) , exón 8: dominio citoplasmático III (sin traducir) y región de 3' sin traducir. Se han identificado siete isoformas de HLA-G, de las cuales 4 están asociadas a membranas (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 y HLA-G4) y 3 son solubles (HLA-G5, HLA-G6 y HLA-G7) (véase, p.ej., Carosella et al., Blood 2008, vol. 111, pág. 4862) .

La isoforma de la proteína HLA-G1 madura comprende los tres dominios externos (a1-a3) , la región transmembrana y el dominio citoplasmático.

La isoforma de la proteína HLA-G2 no comprende el dominio a2, es decir, los dominios a1 y a3 están unidos directamente, seguidos por el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático.

La isoforma de la proteína HLA-G3 carece de ambos dominios a2 y a3, es decir, comprende el dominio a1 unido directamente al dominio transmembrana y al dominio citoplasmático. La isoforma de la proteína HLA-G4 carece del dominio a3, es decir, comprende el dominio a1, el dominio a2, el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático.

Todas las isoformas de HLA-G solubles carecen de los dominios transmembrana y citoplasmáticos. Más específicamente:

La isoforma de la proteína HLA-G5 contiene los dominios a1, a2 y a3, así como una secuencia peptídica C-terminal extra de 21 residuos de aminoácidos codificada por el intrón 4 (como resultado de la retención del intrón 4 tras el corte y empalme del transcrito y la maduración del ARN) .

La isoforma de la proteína HLA-G6 corresponde al HLA-G5 sin a2, es decir, HLA-G6 contiene los dominios a1 y a3, así como una secuencia peptídica C-terminal extra de 21 residuos de aminoácidos codificada por el intrón 4 (como resultado de la retención del intrón 4 tras el corte y empalme del transcrito y la maduración del ARN.

La isoforma de la proteína HLA-G7 contiene solamente el dominio alfa1, así como 2 residuos de aminoácidos Cterminales adicionales codificados por el intrón 2 (como resultado de la retención del intrón 2 tras el corte y empalme del transcrito y la maduración del ARN) .

Todas estas isoformas se han descrito, p.ej., en Kirszenbaum M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 42094213; la solicitud europea EP 0 677 582; Kirszenbaum M. et al., Human Immunol., 1995, 43, 237-241; Moreau P. et al., Human Immunol., 1995, 43, 231-236) .

Los estudios previos han demostrado que las proteínas HLA-G son capaces de inhibir las respuestas alogénicas, tales como la respuesta proliferativa de linfocitos T, la citolisis mediada por linfocitos T citotóxicos, y la citolisis mediada por células NK (Rouas-Freiss N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 5249-5254; Semin Cancer Biol 1999, vol 9, pág. 3) . Como resultado, las proteínas HLA-G se han propuesto para tratar el rechazo de injertos en el transplante alogénico o xenogénico de órganos/tejidos. Las proteínas HLA-G también se han propuesto para tratar cánceres (documento EP1 054 688) , trastornos inflamatorios (documento EP1 189 627) y, más en general, enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario. También se ha propuesto fusionar proteínas HLA-G a ligandos específicos para dirigir HLA-G hacia células o tejidos particulares (documento WO2007091078) . Se debería indicar, sin embargo, que no se han proporcionado resultados o datos experimentales que demuestren que tales fusiones de selección del objetivo son activas.

Las isoformas de HLA-G parecen adoptar una conformación de dímero como resultado de la formación de un puente disulfuro intermolecular entre el residuo de cisteína 42 de los dominios a1 de dos moléculas de HLA-G (Apps et al., Eur. J. Immunol. 2007, vol. 37 pág. 1924; documento WO2007/011044) . Se ha propuesto que los sitios de unión al receptor de los dímeros de HLA-G son más accesibles que los de los monómeros correspondientes, de forma que los dímeros tendrían una afinidad mayor y una velocidad de disociación menor que los monómeros. Sin embargo, no está claro qué conformación es la más activa para fines farmacéuticos, en especial con relación a las formas solubles de HLA-G, ni cómo se pueden producir dímeros u oligómeros de HLA-G adecuados.

Compendio de la invención La presente invención se refiere a proteínas o polipéptidos nuevos, a las composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos, y a los usos de los mismos. De manera más específica, la presente invención se refiere a polipéptidos de fusión nuevos que comprenden una secuencia derivada de HLA-G y una secuencia derivada de un fragmento Fc de inmunoglobulina como se define en la Reivindicación 1. Estos polipéptidos son capaces de formar complejos diméricos funcionalmente activos, y son capaces de inhibir de manera eficaz el rechazo de órganos in vivo. Estos polipéptidos representan así candidatos a fármacos para tratar tales trastornos, así como otras enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario.

Un objetivo de la presente invención reside así en un polipéptido de fusión que comprende: un primer polipéptido que comprende la secuencia de un dominio de un antígeno HLA-G, unido a un segundo polipéptido que comprende la secuencia de un dominio Fc de una inmunoglobulina y que carece de un sitio de unión al antígeno funcional de la inmunoglobulina.

Como se describirá, el dominio de HLA-G contenido en el polipéptido de fusión puede comprender todo o parte de la porción extracelular de un antígeno HLA-G, en general todo o una parte funcional de los dominios a1, a2 y/o a3 de HLA-G. En una realización específica, el dominio Fc comprende una secuencia que es suficiente para permitir la formación de un dímero (homodímero o heterodímero) entre dos polipéptidos de fusión de esta invención y/o no contiene un dominio específico de epítopo/antígeno de la inmunoglobulina.

En una realización particular, el polipéptido de fusión de la invención comprende además un tercer dominio polipeptídico que comprende la secuencia de una º2 microglobulina.

Otro objetivo de esta invención es una forma premadura de un polipéptido como se describió anteriormente, que comprende además una secuencia de péptido señal que provoca la secreción.

Un objetivo adicional de esta invención reside en una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión como se describió anteriormente.

La invención también se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico como se definió anteriormente.

Otro objetivo de esta invención es una célula hospedadora recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico o un vector como se definió anteriormente.

Un objetivo adicional de esta invención es un método para producir un polipéptido como se definió anteriormente, que comprende cultivar una célula hospedadora... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de fusión que comprende (i) un primer polipéptido que comprende la secuencia de un dominio de un antígeno HLA-G unida a (ii) un segundo polipéptido que comprende la secuencia de un dominio Fc de una inmunoglobulina y que carece de un sitio de unión al antígeno funcional de la inmunoglobulina.

2. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en el que el primer polipéptido está en posición N-ter del polipéptido de fusión, y el segundo polipéptido está en posición C-ter.

3. El polipéptido de fusión de la reivindicación 1 ó 2, en el que el segundo polipéptido comprende la secuencia de un dominio Fc de una inmunoglobulina humana o murina.

4. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la inmunoglobulina es una IgG, una IgA, una IgM o una IgE, preferiblemente una IgG.

5. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el antígeno HLA-G es un antígeno HLA-G humano.

6. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio de dicho antígeno HLA-G comprende al menos el dominio a1.

7. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho primer polipéptido se selecciona de:

-la secuencia de aminoácidos de los dominios a1, a2 y a3 de un antígeno HLA-G;

-la secuencia de aminoácidos de los dominios a1 y a3 de un antígeno HLA-G; o

-la secuencia de aminoácidos de los dominios a1 y a2 de un antígeno HLA-G.

8. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos primer y segundo polipéptidos están unidos directamente o por medio de un espaciador.

9. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un tercer polipéptido que comprende la secuencia de una º2 microglobulina.

10. Un polipéptido de fusión, que se selecciona de:

- HLA-G1-B2M-Fc que comprende SEQ ID Nº: 4, o los residuos de aminoácido.

2. 656 del mismo,

- HLA-Ga1-Fc que comprende SEQ ID Nº: 6, o los residuos de aminoácido.

2. 351 del mismo, y

- HLA-G6-Fc que comprende SEQ ID Nº: 2, o los residuos de aminoácido.

2. 452 del mismo.

11. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a

10.

12. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 11.

13. Una célula hospedadora recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 11

o un vector de la reivindicación 12.

14. Un método para producir un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar una célula hospedadora recombinante de la reivindicación 13 en condiciones que permiten la expresión de la molécula de ácido nucleico, y recuperar el polipéptido producido.

15. Un dímero de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

16. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, para tratar el rechazo de órganos o tejidos.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, para tratar una enfermedad inflamatoria o una enfermedad autoinmunitaria.

Dímeros de HLA-G1J2m IhFc

Monómeros de HLA-G1J2m IhFc

Figura 1

Sin tratamiento Control negativo

Cuentas Cuentas Archivo: Specimen_001_Tube_002.fcs Archivo: Specimen_001_Tube_001.fcs Marcador Eventos %Agrup. %Total Media Marcador Eventos %Agrup. %Total Media Todos

Todos

M1

M1

Cuentas Archivo: Specimen_001_Tube_004.fcs Marcador Eventos %Agrup. %Total Media Todos M1

Cuentas Archivo: Specimen_001_Tube_008.fcs Marcador Eventos %Agrup. %Total Media Todos M1

Figura 2

Supervivencia del injerto (%)

Control de HeLa frente a HLA-G6IFc

Días tras el transplante Figura 3

Control de HeLa frente a HLA-G1 b2mIhFc1

Días tras el transplante Figura 4

Control de HeLa frente a alfa1ImFc2

Días tras el transplante Figura 5