Preparación y utilización de una vacuna bivalente contra la adicción a la morfina y la heroína.

Se revela el diseño estructural, métodos de preparación y composición química de dos formulaciones estructurales de vacunas bivalentes contra la adicción a morfina-heroína (morfina-6-hemiscuccinil-EDC-TFCS-toxoide tetánico y 3-0-carboximetilmorfina-EDC-TFCS-toxoide tetánico),

adecuados para su empleo en la vacunación en elhumano, los cuales son capaces de inducir la síntesis de anticuerpos policlonales contra este opiáceo adictivo y contra su análogoestructural la heroína, a través de su administración repetida in vivo, en un esquema de vacunación activa en estudios de fase preclínica en el modelo animal del roedor. También se revela el paradigma de vacunación activa con estos inmunógenos, los cuales soncapaces de inducir una repuesta inmunológica humoral de altos títulos de anticuerpos específicos séricos consolidada con memoriaa largo plazo contra estas dos drogas. En forma complementaria, también se revela que estas composiciones químicas de inmunógenostienen capacidades de conferir inmunoprotección eficaz contra laadicción a la morfina y su congénere estructural altamente adictivo, la heroína, en el modelo farmacológico de autoadministraciónintravenosa adictiva de estos dos opiáceos en el roedor. Finalmente, se discuten las implicaciones terapéuticas del empleo potencial ulterior de estos inmunoconjugados en esquemas de vacunación activa para el tratamiento de la adicción a estas dos drogas en elhumano.

Preparación y utilización de una vacuna bivalente contra la adicción a la morfina y la heroína La presente invención se llevó a cabo gracias al apoyo y asesoramiento científico del Dr. Gerardo Heinze Martín y del Dr. Ramón de la Fuente Muñíz, El trabajo fue financiado por la Fundación Gonzalo del Río Arronte y por el Instituto Nacional de Psiquiatría Ramón de la Fuente Muñíz (Subvención 2040) .

Campo técnico

Se da a conocer un procedimiento para la preparación y utilización de una vacuna bivalente contra la adicción a la morfina y la heroína, la cual puede provocar una fuerte respuesta inmunitaria humoral contra estas dos drogas opioideas adictivas a través de la inmunización activa en en mamíferos incluyendo el ser humano. El procedimiento para la preparación de dicha vacuna bivalente consiste en el diseño, síntesis, purificación, aplicación y validación terapéutica. La formulación estructural de esta vacuna consiste en la síntesis inicial y haptenización de un derivado intermedio morfina-6-hemisuccinato para el toxoide tetánico utilizado como proteína portadora. Esta última etapa química se lleva a cabo utilizando un largo brazo molecular espaciador sintetizado sucesivamente a partir de la condensación covalente del reactivo reticulador homobifuncional, el 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y el reactivo reticulador heterobifuncional N- (£-trifluoroacetilcaproiloxi) -succinimida-éster (TFCS) . La respuesta inmunitaria humoral provocada por la inmunización activa con dicha vacuna estaba caracterizada por la presencia de valores altos y constantes de anticuerpos policlonales circulantes, que reconocen y se unen con especificidad equivalente tanto a la morfina como a la heroína en la sangre, evitando de este modo su penetración en la barrera hematoencefálica en el cerebro. La alteración de la farmacocinética de estas dos drogas conduce a una reducción significativa de la fracción no unida “libre” de morfina y heroína en el plasma, mitigando de este modo la entrada de la droga en el cerebro. Por lo tanto, el antagonismo del anticuerpo en la penetración en la barrera encefálica de los opioideos aumenta un mecanismo inmunoprotector que evita los efectos reforzadores de las drogas de estas dos sustancias opioideas actuando en el sistema remunerador mesocorticolímbico, en roedores vacunados activamente con este inmunógeno previamente preparado para autoadministrar estos dos reforzadores farmacológicos. Por lo tanto, la presente exposición, describe el procedimiento para la preparación de una vacuna bivalente contra la adicción a morfina y/o heroína, la cual representa un nuevo inmunoreactivo o composición farmacéutica o formulación terapéutica que puede aplicarse, valorarse y validarse como un nuevo tratamiento inmunofarmacológico antiadictivo contra estas dos drogas opioideas en protocolos de vacunación activa en seres humanos.

Antecedentes de la invención La drogadicción con propiedades adictivas reforzadoras representa un problema serio de salud pública en todo el mundo. Por ejemplo, en los Estados Unidos de América, casi 48 millones de ciudadanos han estado expuestos a drogas ilegales durante un periodo de un año (Neurobiological Adaptations to Psychostimulants and opiates as basis of treatment development. En: New Medications for Drug Abuse, K. Severino, A. Olivito y T. Kosten, 2000) . Por lo tanto, este problema de salud presenta efectos graves y progresivos los campos social, económico y médico de los países afectados. Epidemiológicamente, los psicoestimulantes tales como la cocaína y las anfetaminas, y en menor medida, las sustancias opioideas, como la heroína y morfina, representan los fármacos más extendidos que causan la morbilidad adictiva más alta en todo el mundo. En los países en vías de desarrollo como México, los datos epidemiológicos de la última Encuesta Nacional de Adicciones (M. E. Medina-Mora y E. Rojas Guiot, Salud Mental, 26 (2) : 1-11, 2003) notificó un aumento alarmante en el consumo de drogas de dichas sustancias en la parte central del país, así como en las ciudades situadas entre México y la frontera de EE.UU. A nivel clínico, hay varias patologías comórbidas relacionadas con la toxicomanía de sustancias ilegales, que se dividen en diferentes categorías. En primer lugar, el alto índice de mortalidad relacionado con los efectos tóxicos provocados por la sobredosis de dichas sustancias. En segundo lugar, la provocación de efectos teratógenos en el recién nacido, que están asociados con frecuencia a la drogadicción de sustancias ilegales por las madres embarazadas adictas. Por último, la alta incidencia de enfermedades comórbidas de adquirir infecciones víricas, tal como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , detectado con frecuencia en toxicómanos de heroína, así como el aumento de los índices de criminalidad, violencia y delincuencia asociados con el tráfico de drogas y el consumo de drogas de dichas sustancias ilegales. Por lo tanto, a nivel terapéutico, existe una necesidad urgente de reenfocar y establecer estrategias de gobierno directas, programas de salud y nuevas medicaciones para luchar eficazmente contra la drogadicción de sustancias ilegales.

La neurobiología de la drogadicción se inició hace más de tres décadas y la mayoría de las investigaciones se han ocupado de la farmacocinética y la farmacodinámica de las drogas. A nivel farmacocinético, la drogadicción con sustancias ilegales tales como la cocaína, la morfina y la heroína, presenta potentes propiedades reforzadoras de las drogas y perfiles farmacocinéticos específicos, que en última instancia conducen a sus altos efectos de drogadicción en el cerebro. La morfina es un alcaloide con una estructura química fenantrénica (véase el ejemplo 1) obtenido a partir del extracto lechoso (goma de opio) de la Papaver somniferum, y representa el principal compuesto extraído (º 10%) junto con otros compuestos estructuralmente relacionados, tales como la codeína, tebaína y papaverina (C. P. O'Brien, Drug Abuse, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics. Págs. 621-642, 10ª ed. J. G. Hardman y L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, Nueva York, 2001) . La morfina posee un grupo hidroxilo en tercera

posición y un grupo hidroxilo alcohólico en sexta posición colocado dentro de la estructura del anillo fenólico. Por el contrario, la heroína, un derivado semisintético de la morfina, tiene dos grupos acetilo condensados en las posiciones mencionadas anteriormente dentro de la estructura de anillo fenantrénico opioideo (C. P. O'Brien, Drug Abuse, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics. Págs. 621-642, 10ª ed. J. G. Hardman y L. E. Limbird eds. McGraw Hill, Nueva York, 2001) . Tanto la morfina como la heroína se absorben en el tubo digestivo y en el aparato respiratorio, incluyendo la mucosa bucal, así como en los espacios subcutáneo, intramuscular, intravascular e intratecal. Estos dos compuestos opioideos presentan un perfil farmacocinético similar sorprendente, en base a su elevada capacidad de penetración en la barrera hematoencefálica, sobre todo debido a sus elevadas propiedades lipófilas (C. P. O'Brien, Drug Abuse, en: The Pharmacological Basis of Therapeutics. Págs. 621-642, 10ª ed. J. G. Hardman y L. E. Limbird, eds. McGraw Hill, Nueva York, 2001) . De hecho, la heroína es relativamente más lipófila que la morfina y por lo tanto penetra más rápido la barrera hematoencefálica que la morfina. La principal ruta catabólica de la morfina se produce principalmente en el hígado y depende de la conjugación enzimática dependiente con ácido glucurónico temperatura tanto en los tres como en los seis grupos hidroxilo situados en la estructura de anillo fenantrénico, produciendo metabolitos endógenos, tales como morfina 3-, morfina 6- y en menor medida, morfina 3-6-glucurónido. Estos compuestos intermedios catabólicos, representan las formas estructurales secretora y/o excretora de la morfina en la orina. Por otra parte, el morfina-6-glucurónido se ha demostrado que presenta potentes efectos analgésicos y psicotrópicos, reforzadores de las drogas en el cerebro. Por lo tanto, los metabolitos de la morfina generados desde el hígado en el torrente sanguíneo, penetran rápidamente la barrera hematoencefálica y activan el subtipo de receptor opioideo mu en las vías de recompensa del cerebro que participan como mediadores de los efectos reforzadoras de la droga (L. M. Kamendulis et al., J. Pharmacol. Exper. Ther. 279:713-717, 1996; C. W. Hutto Jr. y W. Crowder, Pharmacol. Biochem. Behav. 58 (1) :133-140, 1997, A. J. Halliday et al., Life Sci. 65 (2) 225-236, 1999 y D. E. Selley et al., Biochem. Pharmacol. 62:447-455, 2001) . De hecho, estudios farmacocinéticos recientes (véase el estudio y las referencias incluidas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de una composición inmunógena bivalente contra la adicción a la morfina y la heroína que implica una reacción entre una proteína portadora (“CP”) y un producto morfínico, en el que la proteína portadora es el toxoide tetánico y el producto morfínico es EDC- (morfina-6-hemisuccinato) , en el que el producto morfínico está unido a un conjugado intermedio (“CP-TFCS”) en la composición, y en el que la composición se prepara según las etapas siguientes:

a) hacer reaccionar 100 mg (0, 5 mM) de toxoide tetánico disuelto en 4 ml de una solución tampón de fosfato/NaCl 0, 15 mM, pH 7, 2 con 50 Il de 40 mg/ml de una solución madre de N- (£-trifluoroacetilcaproiloxi) succinimida-éster (“TFCS”) que contiene 10 a 20% de DMSO y 90 a 80% de H2O desionizada (v:v) , para empezar la formación del conjugado intermedio;

b) obtener una concentración final de toxoide tetánico de 6, 7 mM 0, 5-1% de DMSO; 15 c) obtener una dilución final de 1:10-20 (v:v) de la concentración inicial de DMSO entre el toxoide tetánico y TFCS;

d) incubar el contenido de la etapa c) durante hasta 60 a 90 minutos a temperatura ambiente, en el que tiene 20 lugar la síntesis de CP-TFCS, y en el que TFCS todavía conserva un grupo amino reactivo protegido por un grupo químico protector trifluoroacetilo;

e) incubar el CP-TFCS durante 2 a 3 horas a temperatura ambiente y ajustar el pH a 8-8, 5, con una solución de NaOH 10 N concentrada para enriquecer el grupo trifluoroacetilo protegido en TFCS que debe hidrolizarse, a 25 fin de generar grupos amino reactivos libres en el CP-TFCS;

f) purificar el CP-TFCS utilizando procedimientos de diálisis estándar;

g) hacer reaccionar el producto morfínico, EDC- (morfina-6-hemisuccinato) , con el CP-TFCS, en el que la 30 reacción se lleva a cabo en una proporción estequiométrica haciendo reaccionar mol:mol, 100 Imoles de EDC- (M-6-H) por cada 0, 07 Imoles de grupos amino libre activos del CP-TFCS;

h) incubar los reactantes obtenidos en la etapa g) 2 a 3horas a temperatura ambiente en agitación lenta y constante para formar la composición inmunógena; 35 i) purificar la composición inmunógena utilizando procedimientos de diálisis estándar;

j) esterilizar la composición inmunógena por procedimientos de filtración a presión positiva utilizando filtros de membrana de 0, 45 Im de tamaño de poro; 40 k) liofilizar alícuotas de 1 ml de la composición inmunógena en viales de vidrio estériles sellados al vacío y almacenarlos a 4ºC para su conservación.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa f) de purificación del CP-TFCS comprende dializar el

CP-TFCS con membranas de diálisis con umbral de 10 kDa de peso molecular durante hasta 24 horas a 4ºC frente a tres cambios de 6 litros de solución tampón de fosfato 0, 1 M, pH 7, 2 cada 8 horas.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa i) de purificación de la composición inmunógena comprende dializar la composición inmunógena con membranas de diálisis con umbral de 10 kDa de peso molecular

durante hasta 24 horas a 4ºC frente a tres cambios de 6 litros de solución tampón de fosfato 0, 1 M, pH 7, 2 cada 8 horas.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el CP-TFCS comprende la fórmula estructural siguiente: 55

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el toxoide tetánico está unido por enlaces covalentes a través de sus grupos amino épsilon de la cadena lateral de los restos de lisina expuestos en el CP-TFCS.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa g) se obtiene mediante un enlace amídico covalente, formado al hacer reaccionar los grupos imídicos expuestos en el extremo libre de EDC (M-6-H) y los grupos amino libres no protegidos expuestos del TFCS conjugado procedente del CP-TFCS.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la composición inmunógena presenta la estructura representada en la fórmula siguiente:

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además la etapa de formular la composición inmunógena con uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables y/o uno o más agentes farmacológicos.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el adyuvante farmacéuticamente aceptable es el hidróxido de 20 aluminio.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 o 9, en el que el agente farmacológico es la naltrexona.

11. Composición inmunógena bivalente contra la adicción a la morfina y la heroína que presenta una de las fórmulas 25 estructurales siguientes:

o en la que la proteína portadora (CP) es el toxoide tetánico.

12. Composición inmunógena de la reivindicación 11, que comprende además uno o más adyuvantes o agentes farmacológicos farmacéuticamente aceptables.

13. Composición inmunógena según la reivindicación 12, en la que el adyuvante farmacéuticamente aceptable es el

hidróxido de aluminio y el agente farmacológico es la naltrexona. 10