Péptido sintético que se enlaza con CD154 humano y usos del mismo.

Un péptido capaz de enlazarse selectivamente al sitio activo del receptor de CD154 y capaz de inhibir lainteracción CD40:

CD154, que comprende la secuencia de siete aminoácidos de enlazamiento de CD154 SEQ IDNO: 13.

Péptido sintético que se enlaza con CD154 humano y usos del mismo La presente invención se refiere a un péptido sintético que es capaz de enlazarse con el ligando CD40 humano (CD40L o CD154) . En particular, la presente invención se refiere a un péptido sintético que tiene una secuencia de aminoácidos que es capaz de enlazarse específicamente al sitio activo de CD154, inhibiendo de este modo la interacción entre CD154 y su ligando natural CD40, así como los efectos biológicos dependiendo de tal interacción. La invención también se refiere a los usos del péptido en el diagnóstico y terapia de enfermedades que tienen un origen inflamatorio, inmunológico o hematológico.

CD40 es una molécula expresada constitutivamente en la superficie de las células B, en donde desempeña un papel crucial durante el proceso de maduración. CD40 también se expresa en la superficie de una cantidad de otros tipos de células, incluyendo monocitos, fibroblastos, células dendríticas, células endoteliales, células del músculo liso y células epiteliales (van Kooten et al., J. Leukoc. Biol. 2000) . Su ligando, CD154 (también denominado como CD40L) , se expresa transitoriamente tras la activación en la superficie de las células T, macrófagos, plaquetas, monocitos, células NK y células endoteliales. En particular, la interacción entre CD40 expresado en la superficie de las células B y CD154 expresado en la superficie de las células T activadas, conduce a la expansión clonal y el cambio de isotipo de células B, lo que resulta en su transformación en plasmocitos.

La importancia de la interacción CD40:CD154 en el desarrollo de una respuesta inmune efectiva se demuestra por el hecho de que una mutación en el gen que codifica CD154 es responsable de una forma humana severa de inmunodeficiencia, el síndrome de híper IgM (HIM) , caracterizado por la sobreproducción de IgM, pero la ausencia de IgG, IgA e IgE, y acompañada de graves infecciones recurrentes (Aruffo A. et al., Cell, 1993) .

En los últimos años, muchos estudios han demostrado la participación de la interacción CD40:CD154 en muchos procesos con una etiogénesis inflamatoria, tal como la aterosclerosis, las enfermedades autoinmunes, el rechazo después del trasplante, la enfermedad de injerto contra huésped, etc. (Schonbeck U. et al., Circ. Res. 2001; Henn V. et al., Nature 1998; Biancone L. et al., Int. J. Mol. Med. 1999; Buchner K. et al., J. Pathol. 2003) . La expresión de CD40 o su ligando CD154 o la coexpresión de ambas moléculas, también ha sido demostrado en muchos tumores, lo que sugiere la participación de esta ruta de señalización en el desarrollo tumoral (Bussolati B. et al., Int. J. Cancer 2002; Biancone L. et al., J. Immunol. 1999; Cantaluppi V. et al., Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2006; Hill S. C. et al., J. Immunol. 2005; Melichar B. et al., Gynecol. Oncol. 2007; Eliopoulos A. G. et al., Curr. Opin. Pharmacol. 2004) . En particular, se considera que la ruta de señalización CD40:CD154 está implicada en el progreso de la leucemia linfocítica crónica (LLC) , en la que se ha demostrado que promueve tanto la supervivencia de las células tumorales como las propiedades pro-angiogénicas de células endoteliales (Dicker F. et al., Blood 2006) .

Una cantidad de enfoques dirigidos a la inhibición de la interacción CD40:CD154 fueron desarrollados con el fin de proporcionar nuevas oportunidades terapéuticas. En particular, se obtuvieron resultados prometedores en diferentes modelos experimentales de enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y rechazo de trasplantes. La inhibición de la interacción CD40:CD154 a través de un enfoque basado en anticuerpos monoclonales anti-CD154 proporcionó mejoras clínicas en muchos modelos de enfermedades autoinmunes, tales como lupus eritematoso sistémico (LES) , artritis reumatoide (AR) , psoriasis y enfermedad de Crohn (Boumpas D. T. et al., Arthritis Rheum. 2003; Liossis S. N. et al., Bio Drugs 2004; Daoussis D. et al., Clin. Diagn. Lab. Immun. 2004) . Los anticuerpos anti-CD154 también se describen en la literatura de patentes. El documento WO 2005/003175 da a conocer anticuerpos aglicosil anti-CD154, el documento WO 2006/033702 da a conocer anticuerpos y péptidos anti-CD154, en particular regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada de anticuerpos. Por otra parte, una serie de artículos demostraron que el uso de anticuerpos monoclonales en ratones después del trasplante de islotes, piel, médula ósea, corazón y riñón conduce a la supervivencia prolongada de los órganos trasplantados (Molano R. D. et al., Diabetes 2001; Quezada S. A. et al., Blood 2003; Elster E. A. et al., Transpl. Immunol. 2004; Xu H. et al., J. Clin. Investig. 2006; Snanoudj R. et al., Transpl. Int. 2006; Nanji S. A. et al., Diabetes 2006) . El bloqueo de la coestimulación puede conseguirse con anticuerpos monoclonales, fragmentos Fab o proteínas de fusión dirigidos contra las moléculas coestimuladoras. Sin embargo, los resultados de estos enfoques están a menudo comprometidos por el riesgo de efectos inmunogénicos y efectos secundarios protrombóticos, que son debidos al reconocimiento de la fracción Fc (Henn V. et al., Nature 1998) , y por la pobre penetración en el tejido y la inmunosupresión. Para reducir la inmunogenicidad inherente, se desarrollaron mini-anticuerpos y humanizado, pero por desgracia a costa de la afinidad.

Péptidos capaces de inhibir la interacción CD40:Cd154 han sido divulgados en MINITAKE KITAGAWA ET AL.,

Official Journal of the Japan College of Rheumatology, Springer-Verlag, To, Vol. 15, no. 6, 1 de diciembre de 2005, páginas 423 - 426. Un objetivo de la presente invención es proporcionar un reactivo que es capaz de inhibir la interacción CD40:CD154 y el bloqueo de los efectos biológicos que dependen de tal interacción, y que supera las limitaciones e inconvenientes de la técnica anterior, en particular lo relacionado con el uso de anticuerpos anti-CD154 monoclonales.

Este objetivo se consigue mediante un péptido sintético, por ejemplo en una forma cíclica, que es capaz de enlazarse específicamente con el sitio activo de CD154 humano (también denominado como CD40L humana) .

El péptido de la invención comprende la secuencia de enlazamiento de CD154 de siete aminoácidos denominada como la SEQ ID NO: 13 en el listado de secuencias.

De acuerdo con una forma de realización preferida, el péptido de la invención es de 7 a 30 aminoácidos de longitud.

De acuerdo con una forma de realización aún más preferida, el péptido de la invención consiste de la secuencia de nueve aminoácidos denominada como la SEQ ID NO: 6 en el listado de secuencias, resultante de la adición de residuos de cisteína que flanquean en ambos extremos de la secuencia de enlazamiento de CD154 de siete aminoácidos denominada como la SEQ ID NO: 13. Esta forma de realización es particularmente ventajosa ya que la SEQ ID NO: 6 es capaz de sufrir ciclización por la formación de un enlace disulfuro entre las dos cisteínas terminales.

El péptido de acuerdo con la invención tiene la ventaja de que no es capaz de inducir respuestas inmunes no deseadas en el paciente al que se administra.

De acuerdo con una forma de realización adicional, el péptido de la invención se proporciona en forma de una estructura de péptido multimérico que comprende una pluralidad de copias del péptido, siendo cada una de dichas copias de péptidos ya sea de forma lineal o en una forma cíclica. La estructura del péptido multimérico es preferiblemente una estructura tetramérica. La estructura del péptido multimérico consiste preferiblemente en una pluralidad de copias del péptido, en las que cada copia se enlaza a al menos otra copia por al menos un espaciador de aminoácidos, que es preferiblemente un residuo de G (Gly) , y en el que cada una de las copias de péptidos está enlazada directa o indirectamente a un núcleo de aminoácidos, que consiste preferiblemente de tres residuos K (Lys) .

Una estructura peptídica multimérica de acuerdo con la invención se representa a continuación:

en la que L es Leu, P es Pro, T es Thr, R es Arg, H es His, M es Met, A es Ala, G es Glyy K es Lys.

La estructura multimérica ilustrada anteriormente se ha demostrado que ejerce, en una concentración de 60 μM, la misma actividad inhibidora sobre la estimulación de CD40 por CD154 soluble recombinante que el péptido 4.10, a pesar de que contiene las secuencias de enlazamiento a CD154 de la SEQ ID NO: 13 en una forma lineal. Por otra parte, la estructura tetramérica, similar al péptido 4.10, resultó inactiva en la activación de la agregación plaquetaria humana con trombina con una dosis subliminar (0, 3 U/ml) . Estos resultados indican que la secuencia de enlazamiento... [Seguir leyendo]

1. Un péptido capaz de enlazarse selectivamente al sitio activo del receptor de CD154 y capaz de inhibir la interacción CD40:CD154, que comprende la secuencia de siete aminoácidos de enlazamiento de CD154 SEQ ID NO: 13.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que es de 7 a 30 aminoácidos de longitud.

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de aminoácidos de enlazamiento de CD154 SEQ ID NO. 13 está flanqueada por 1 cisteína en cada extremo de la secuencia, proporcionando de este modo la secuencia de nueve aminoácidos SEQ ID NO: 6.

4. El péptido de acuerdo con la reivindicación 3, que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

5. Una estructura multimérica que comprende una pluralidad de copias del péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. La estructura multimérica de acuerdo con la reivindicación 5, en donde cada una de las copias del péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 está enlazada con al menos otra copia por medio de al menos un espaciador de aminoácidos.

7. La estructura multimérica de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el espaciador de aminoácidos es un residuo de Gly (G) .

8. La estructura multimérica de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende un núcleo de aminoácidos al cual está directa o indirectamente enlazado cada una de las copias del péptido, en donde el núcleo de aminoácidos se compone de una pluralidad de residuos de Lys (K) .

9. Un conjugado que comprende al menos un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o al menos una estructura multimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, conjugado con una molécula seleccionada del grupo que consiste de biomoléculas, agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos.

10. El conjugado de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el agente terapéutico es un agente antiinflamatorio, inmunosupresor, inmunomodulador o anti-tumoral.

11. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la estructura multimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para uso como un medicamento.

12. El uso de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una estructura multimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con la interacción CD40:CD154.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la enfermedad o el trastorno es inflamación.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la inflamación es una enfermedad inflamatoria seleccionada entre aterosclerosis, enfermedades autoinmunes, rechazo de trasplantes.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la enfermedad es una enfermedad tumoral.

16. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una estructura multimérica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, y un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.