Partículas de hidrogel inteligentes para la recogida de biomarcadores.

Un método para inhibir o prevenir la degradación de analitos de proteínas en una muestra que también contieneuna proteasa,

que comprende poner en contacto la muestra con partículas de captura para los analitos, en donde laspartículas de captura comprenden una matriz polimérica que tiene un tamaño de poros que, bajo determinadascondiciones, permite que los analitos y la proteasa penetren en la matriz polimérica, al tiempo que excluyen queotros compuestos penetren en la matriz polimérica, permitiendo a la muestra y a las partículas de capturapermanecer en contacto durante un período de tiempo para que las partículas de captura secuestren los analitos yproteasa y, con ello, inhiban o eviten la degradación de los analitos secuestrados.

Partículas de hidrogel inteligentes para la recogida de biomarcadores Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para la recogida de biomarcadores a partir de una mezcla utilizando partículas. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos que utilizan partículas capaces de secuestrar un biomarcador a partir de una mezcla, permitiendo la separación del biomarcador a partir de la mezcla, así como a métodos para secuestrar biomarcadores.

Antecedentes de la invención Los biomarcadores pueden proporcionar una detección en fase temprana de una amplia diversidad de enfermedades. Como tal, existe una urgente necesidad de descubrir nuevos biomarcadores que proporcionen una detección sensible y específica de la enfermedad (Aebersold et al., Proteome Res 2005, 4, (4) , 1104-9; Srinivas et al., Clin Chem 2002, 48, (8) , 1160-9) . Los biomarcadores proporcionan un modo de diagnosticar una enfermedad antes de que aparezcan patologías clínicas, permitiendo un tratamiento en fase temprana de la enfermedad, lo cual, típicamente, proporciona resultados mejores.

Por ejemplo, el cáncer se está convirtiendo rápidamente en la causa principal de muerte para muchos grupos de población en los Estados Unidos de América, en gran parte debido al hecho de que diversos tipos de la enfermedad son habitualmente diagnosticados después de que el cáncer se haya metastatizado. En esta fase tardía de la enfermedad, el tratamiento es típicamente invasivo e ineficaz. Se piensa generalmente que la detección temprana del cáncer antes de la metástasis conducirá a una mejora drástica en el resultado del tratamiento.

Continuamente se están descubriendo también biomarcadores que son indicativos de otros diversos estados patológicos y afecciones tan variados como la enfermedad de Alzheimer y la diabetes. Para muchas de estas enfermedades, el diagnóstico temprano de la enfermedad permite opciones de tratamiento que tienen una mayor posibilidad de éxito que un tratamiento en fase tardía. Además, en algunos casos, el diagnóstico temprano de una enfermedad o predisposición a una enfermedad puede incluso permitir a la persona diagnosticada que realice cambios en su estilo de vida que puedan ayudar a prevenir e invertir el curso de la enfermedad sin la necesidad de un tratamiento médico más implicado.

Los biomarcadores son ácidos nucleicos, proteínas, fragmentos de proteínas o metabolitos indicativos de un estado biológico específico, que están asociados con el riesgo de contraer o presentar una enfermedad (Frank y Hargreaves; Nature reviews 2003, 2, (7) , 566-80) . La investigación de biomarcadores ha revelado que proteínas y 30 péptidos circulantes de baja abundancia presentan una fuente rica de información en relación con el estado del organismo en su conjunto (Espina et al. Proteomics 2003, 3 (11) , 2091-100) . Dos obstáculos principales han evitado que estos descubrimientos alcancen un beneficio clínico: 1) biomarcadores relevantes de la enfermedad en la sangre o fluidos corporales pueden existir en concentraciones sumamente bajas dentro de una mezcla compleja de biomoléculas y podrían ser enmascarados por especies de alta abundancia tales como albúmina, y 2) la degradación de biomarcadores proteína puede producirse inmediatamente después de la recogida de sangre o del fluido corporal como resultado de proteinasas endógenas o exógenas.

La concentración de proteínas y péptidos que comprenden el proteoma circulatorio complejo oscila entre 10-12 mg/mL y 10-3 mg/mL, abarcando diez órdenes de magnitud, representando unas pocas proteínas de elevado peso molecular tales como albúmina e inmunoglobulinas el 90% del contenido total en proteínas (Anderson y Anderson, 40 Mol Cell Proteomics 2002, 1, (11) , 845-67) . Sin embargo, las proteínas de baja abundancia y de bajo peso molecular y los metabolitos también presentes en la sangre proporcionan una riqueza de información y suponen una gran promesa como fuente de nuevos biomarcadores. Métodos convencionales tales como electroforesis en gel bidimensional, no tienen la sensibilidad ni la resolución para detectar y cuantificar proteínas de baja abundancia de bajo peso molecular y metabolitos. También, a pesar de la sensibilidad moderadamente elevada de los modernos 45 espectrómetros de masas (concentración atomolar) , su intervalo de funcionamiento abarca más de tres-cuatro órdenes de magnitud y, por lo tanto, las proteínas menos abundantes están enmascaradas por proteínas más abundantes. Por consiguiente, las etapas de preparación de muestras habituales para experimentos de espectrometría de masas (EM) comienzan con el agotamiento de proteínas muy abundantes utilizando columnas de agotamiento de inmunoafinidad comercialmente disponibles (Agilent, Sigma y Beckman-Coulter) . Después del 50 agotamiento, se realiza el fraccionamiento por medio de cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de intercambio de iones y/o enfoque isoeléctrico. Sin embargo, la separación de proteínas de elevado peso molecular abundantes nativas puede reducir significativamente el rendimiento de biomarcadores candidatos, ya que recientemente se ha demostrado que la vasta mayoría de biomarcadores de baja abundancia están asociados de forma no covalente y endógena con las proteínas de soporte que están siendo separadas (Lopez et al., Cinical 55 chemistr y 2007, 53, (6) , 1067-74; Conrads et al., Bio Techniques 2006, 40, (6) , 799-805; Lowenthal et al., Clin Chem

2005, 51, (10) , 1933-45) ; Lopez et al., Clinical chemistr y 2005, 51 (10) , 1946-54) . Para resolver este problema se han propuesto métodos tales como la ultrafiltración de exclusión por tamaños bajo condiciones desnaturalizantes (Zolotarjova et al., Proteomics 2005, 5, (13) , 3304-13) , la electroforesis desnaturalizante por elución continua (Camerini et al., Proteomics Clin. Appl. 2007, 1, 176-184) o el fraccionamiento de suero por medio de sustratos no porosos (Geho et al., Bioconjug Chem 2006, 17, (3) , 654-61) . Además de ello, estos mismos hallazgos recientes apuntan a la región de bajo peso molecular del proteoma como una fuente rica y sin explotar de candidatos biomarcadores (Tirumalai et al., Molecular & cellular proteomics 2003, 2, (10) , 1096-103; Merrell et al., J of biomolecular techniques 2004, 15, (4) , 238-48; Orvisky et al. Proteomics 2006, 6, (9) , 2895-902) .

Además de las dificultades asociadas con la recogida y el enriquecimiento de biomarcadores candidatos a partir de mezclas de proteínas naturales complejas (tales como sangre) , la estabilidad de estos biomarcadores potenciales plantea un reto. Inmediatamente después de la obtención de sangre (p. ej. por venipuntura) , las proteínas en el suero se vuelven susceptibles a la degradación por parte de proteasas endógenas o proteasas exógenas del entorno tales como proteasas asociadas con el proceso de coagulación de la sangre, enzimas liberadas de hematíes o asociadas con contaminantes bacterianos. Por lo tanto, biomarcadores diagnósticos candidatos en la sangre se pueden someter a degradación durante el transporte y almacenamiento. Esto se convierte en un asunto incluso más importante para la fidelidad de biomarcadores dentro de grandes depósitos de suero y fluidos corporales que son recogidos de una amplia diversidad de instituciones y lugares en los que las muestras pueden ser transportadas sin congelación.

Como tal, existe una necesidad en la técnica de partículas que permitan el enriquecimiento y encapsulación de clases seleccionadas de proteínas y péptidos a partir de mezclas complejas de biomoléculas tales como plasma, y que las proteja de la degradación durante la subsiguiente manipulación de la muestra. Los analitos capturados podrían ser entonces fácilmente extraídos de las partículas mediante electroforesis, permitiendo un análisis cuantitativo subsiguiente. Partículas de este tipo proporcionarían una poderosa herramienta que es adecuada de forma exclusiva para el descubrimiento de nuevos biomarcadores para enfermedades en fase temprana tales como cáncer.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un método para inhibir o prevenir la degradación de analitos de proteínas en una muestra de material biológico que también contiene una proteasa, que comprende poner en contacto la muestra con partículas de captura para los analitos, en donde las partículas de captura comprenden una matriz polimérica que tiene un tamaño de poros que, bajo determinadas condiciones, permite que los analitos y la proteasa penetren en la matriz polimérica, al tiempo que excluyen que otros compuestos penetren en la matriz polimérica, permitiendo a la muestra y a las partículas de captura permanecer en contacto durante un período de tiempo... [Seguir leyendo]

1. Un método para inhibir o prevenir la degradación de analitos de proteínas en una muestra que también contiene una proteasa, que comprende poner en contacto la muestra con partículas de captura para los analitos, en donde las partículas de captura comprenden una matriz polimérica que tiene un tamaño de poros que, bajo determinadas condiciones, permite que los analitos y la proteasa penetren en la matriz polimérica, al tiempo que excluyen que otros compuestos penetren en la matriz polimérica, permitiendo a la muestra y a las partículas de captura permanecer en contacto durante un período de tiempo para que las partículas de captura secuestren los analitos y proteasa y, con ello, inhiban o eviten la degradación de los analitos secuestrados.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el analito de proteína se selecciona del grupo que consiste en: proteínas, glicoproteínas, proteolípidos, hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, biomarcadores, compuestos de fármacos, odorantes volátiles, productos tóxicos y contaminantes.

3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la matriz polimérica es expandible y contráctil; opcionalmente, en los casos en los que la matriz polimérica se expande o contrae, el tamaño de los poros de la matriz de gel se expande o contrae, respectivamente.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que

(a) la matriz polimérica es expansible y contráctil en respuesta a un estímulo aplicado; preferiblemente, en donde el estímulo aplicado es un cambio térmico, eléctrico, magnético, de ultrasonidos, presión, radiante, láser, osmótico o de pH; o

(b) la matriz polimérica es expansible o contráctil tras el tratamiento con una enzima.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la matriz polimérica puede comprender, además, un agente atrayente; opcionalmente

(a) en donde el agente atrayente es secuestrado con la partícula de captura; o

(b) en donde el agente atrayente es unido de forma covalente a la partícula de captura; o

(c) en donde el agente atrayente está integrado en la matriz polimérica.

6. Un método según la reivindicación 5, en el que el agente atrayente es un ligando de afinidad; opcionalmente, en donde el ligando de afinidad comprende un anticuerpo o proteína, un aptámero, ácido nucleico, un fármaco, un producto químico, un metabolito, un lípido, un glicolípido, un fosfolípido, un polipéptido, un grupo de afinidad o un grupo metálico.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la matriz polimérica es una matriz copolimérica que comprende un monómero estructural y un monómero de afinidad.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que el monómero estructural se selecciona del grupo que consiste en: acrilamida y derivados de la misma, acrilamidas N-alquil-sustituidas; N, N-metilenbisacrilamida, N, Ncistaminbisacrilamida, N-vinilalquilamidas, ácido acrílico, ácido metacrílico, alilamina, estireno, glutamato de bencilo, acido 2-etilacrilico, 4-vinilpiridina, silicona, metacrilato de hidroxietilo, óxido de etileno, tereftalato de butilenos, ácido 2-acrilamido-2-metil-1-propanosulfónico, vinilpirrolidona, etileno-acetato de vinilo, lactida, glicolida, caprolactona, hidroxialcanoatos, quitosano, ácido hialurónico, almidón, celulosa y agarosa; más preferiblemente, en el que el monómero estructural es ácido N-isopropilacrílico.

9. Un método según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el monómero de afinidad

(a) comprende un resto cargado positivamente; preferiblemente, en el que el resto cargado positivamente se selecciona del grupo que consiste en: grupos aminas y grupos amida; o

(b) comprende un resto cargado negativamente; preferiblemente, en el que el resto cargado negativamente se selecciona del grupo que consiste en: grupos ácidos carboxílico, grupos hidroxilo, grupos tiol y grupos fosfato; o

(c) se selecciona del grupo que consiste en: colorantes de afinidad, grupos ácido borónico, ácidos nucleicos, glicopéptidos, glicoproteínas, ciclodextrinas, calixarenos, grupos porfirina y grupos alifáticos; o

(d) en el que el monómero de afinidad es ácido acrílico.

10. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la partícula de captura tiene un núcleo que comprende una matriz co-polimérica que comprende un monómero estructural y un monómero de

afinidad; y

una envoltura que comprende una matriz polimérica que comprende un monómero de envoltura, en donde la matriz co-polimérica y la matriz polimérica tienen cada una un tamaño de poros que, bajo determinadas condiciones, permiten que el analito penetre en las matrices, al tiempo que excluyen que otros compuestos de la muestra penetren en las matrices.

11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la partícula de captura tiene un tamaño del corte del peso molecular de 5 a 100 kDa; preferiblemente, 20 a 50 kDa.

12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende, además, aislar las partículas de captura de la muestra; y liberar el analito de la partícula de captura; preferiblemente, en el que el aislamiento de las partículas de captura se realiza moviendo físicamente las partículas; opcionalmente (a) en el que las partículas se mueven físicamente mediante exposición a un campo magnético, un campo eléctrico, un gradiente de pH, un gradiente de disolventes, un flujo de fluido, un flujo microfluídico o una fuerza física; o (b) en el que las partículas se mueven físicamente uniendo las partículas a un sustrato; preferiblemente, en el 15 que el sustrato es una perla o una superficie.

13. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la matriz polimérica tiene un tamaño de poros que, bajo una primera condición, permite que el analito atraviese el poro, y que tiene un tamaño de poros bajo una segunda condición, que no permite que el analito atraviese el poro; y en el que la muestra contactada y las partículas de captura se exponen a la primera condición durante el período de tiempo suficiente para que las partículas de captura secuestren el analito; seguido de exponer las partículas de captura a la segunda condición;

aislar las partículas de captura de la mezcla; y

re-exponer las partículas de captura a la primera condición para liberar el analito de la partícula de captura.