Oligonucleótidos catiónicos, procedimientos automáticos para preparar los mismos y sus usos.

Moléculas de oligonucleótido-oligocatión AiBjH que se pueden sintetizar mediante química de fosforoamiditaautomática Ai y restos oligocationes Bj,

en los que

. Ai es un residuo oligonucleotídico de i unidades, siendo i ≥ 5 a 50 con bases nucleotídicas naturales o nonaturales y/o grupos de pentafuranosilo y/o enlaces fosfodiéster nativos, así como sus modificaciones ysustituciones químicas,

. Bj es un resto oligocatiónico orgánico de j unidades, siendo j ≥ 1 a 50, en la que B se selecciona del grupo queconsiste en

• -HPO3-R1-(X-R2n)n1-X-R3-O-, en la que R1,R2 y R3, idénticos o diferentes, son alquileno inferior, X es NH oNC(NH2)2, n varía de 1 a 5 y n1 ≥ 2 a 20,

• -HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-, en la que R4 es alquileno inferior, R5 y R6, idénticos o diferentes, sonalquileno inferior y X1 15 es putrescina, espermidina o residuo de espermina,

en el que el alquileno inferior es un radical alquileno C1-C5 lineal o ramificado opcionalmente sustituido.

Oligonucleótidos catiónicos, procedimientos automáticos para preparar los mismos y sus usos [0001] La invención se refiere a oligonucléotidos catiónicos, es decir a moléculas de oligonucleótido-oligocatión, también denominados oligonucleótidos catiónicos en la descripción (con independencia de su carga global) que se pueden sintetizar por etapas en un sintetizador de oligonucleótidos. También atañe a sus aplicaciones de uso en biología molecular, diagnósticas y terapéuticas.

Los oligonucleótidos encuentran un número extremadamente grande de aplicaciones en biología molecular y diagnóstico, y pueden llegar a ser una clase muy selectiva de fármacos para el tratamiento de una gran paleta de enfermedades.

Los oligonucleótidos son polianiones que ejercen su actividad específica tras la hibridación a una secuencia 15 complementaria transportada por otro ácido nucleico polianiónico.

Como candidatos a fármacos, deben ser capaces de atravesar la membrana celular aniónica.

Simples consideraciones electrostáticas implican que la energía de hibridación y la unión celular podrían 20 beneficiarse de la adición de grupos catiónicos a la estructura de los oligonucleótidos.

Con este objetivo se han explorado muchos abordajes sintéticos para introducir residuos de amonio o de guanidinio en oligonucleótidos: sustitución de la estructura de fosfato, modificación de la ribosa o la base nucleica y conjugación final de un policatión. No obstante, la especificidad de hibridación, la actividad enzimática de 25 procesamiento de ácido nucleico así como la toxicidad de los metabolitos atañe en todo punto al abordaje de bloqueo, en el que el policatión se añade a un oligonucleótido de otro modo natural, como mejor solución. Por desgracia, la síntesis automática escalonada de conjugados peptídicos catiónicos-oligonucleótido todavía no es una rutina. Por otro lado, la química de conjugación entre bloques grandes preformados no es directa, especialmente en agua, donde "súper” zwiteriones producen problemas intratables de solubilidad, purificación y caracterización.

Además, las aplicaciones en biología molecular y diagnóstico requieren una rápida y directa síntesis de cualquier secuencia de bases unida a un catión orgánico de cualquier longitud.

Los inventores han descubierto que era posible una síntesis online dirigida por ordenador de moléculas de oligonucleótido-oligocatión introduciendo viales que contienen derivados oligocatiónicos protegidos y 35 adecuadamente activados en un sintetizador de oligonucleótidos además de los de las cuatro bases naturales.

Por tanto, un objeto de la invención es proporcionar nuevos oligonucleótidos catiónicos.

Otro objeto de la invención es proporcionar una síntesis automática de alto rendimiento de dichos 40 oligonucleótidos catiónicos.

En un objeto adicional, la invención se refiere a las aplicaciones de dichos oligonucleótidos catiónicos, en particular en biología molecular, diagnóstico y terapéuticas.

Por tanto, la invención se refiere a moléculas mixtas de oligocatión–oligonucleótido que se pueden sintetizar mediante química de fosforoamidita automática, es decir polifosfodiésteres.

Más particularmente, los oligonucleótidos catiónicos AiBjH de la invención tienen restos oligonucleotídicos Ai y restos oligocationes Bj, en los que 50 Ai es un residuo oligonucleotídico de i unidades, siendo i = 5 a 50 con bases nucleotídicas naturales o no naturales y/o grupos de pentafuranosilo y/o enlaces fosfodiéster nativos, Bj es un resto oligocatiónico orgánico de j unidades, siendo j = 1 a 50, en la que B se selecciona del grupo que consiste en 55 • -HPO3-R1- (X-R2n) n1-X-R3-O-, en la que R1, R2 y R3, idénticos o diferentes, son X alquileno inferior, X es NH o NC (NH2) 2, n varía de 1 a 5 y n1 = 2 a 20, • -HPO3-R4-CH (R5X1) -R6-O-, en la que R4 es alquileno inferior, R5 y R6, idénticos o diferentes, son alquileno inferior y X1 es putrescina, espermidina o residuo de espermina,

"Alquilo inferior" y "alquileno inferior", como se usa en la descripción y las reivindicaciones, designan un radical alquilo o alquileno C1-C5 opcionalmente sustituido lineal o ramificado, respectivamente.

A se selecciona de, por ejemplo, el grupo que comprende desoxirribo, ribo, nucleótidos bloqueados (LNA) así como sus modificaciones o sustituciones químicas tales como fosforotioato (también denominado tiofosfato) , 2'65 fluoro, 2'-O-alquilo o un grupo marcador tal como un agente fluorescente.

Moléculas mixtas de oligonucleótido-oligocatión de la invención tienen la secuencia 3'A5'- B. [0016] Otras moléculas de la invención tienen la secuencia B - 3'A5. [0017] Otras moléculas más de la invención tienen la secuencia B - 3'A5'- B o 3'A5'- B -3'A5'. [0018] Dicha secuencia se ilustra en los ejemplos mediante una molécula de oligonucleótido-espermina que tiene la

estructura siguiente:

en la que A, i y j son como se ha definido con anterioridad.

Moléculas en las que A es un nucleótido fosforotioato son particularmente ventajosos a la luz de sus 15 aplicaciones biológicas, ya que los oligonucleótidos de fosforotioato no se hidrolizan en fluidos biológicos.

Los oligonucleótidos catiónicos definidos anteriormente forman complejos rápidos y estables con su secuencia complementaria en un contexto de sustitución de hebra e incluso en un contexto de invasión de hebra en plásmido, como se ilustra mediante los ejemplos.

Debido a la conjugación final, la selectividad de la secuencia sigue siendo tan alta como para los nucleótidos naturales.

De acuerdo con esto, los oligonucleótidos catiónicos de la invención son de gran interés para reactivos de investigación de biología molecular y aplicaciones diagnósticas, tales como PCR, PCR en tiempo real, genotipado, hibridación in situ y circuitos de ADN.

Dichas aplicaciones también están cubiertas por la invención y comprenden el uso de moléculas de oligonucleótido-oligocatión como las definidas anteriormente.

Al contrario que los oligonucleótidos aniónicos, en los ejemplos se ha demostrado que los oligonucleótidos catiónicos de la invención entran de forma espontánea en el citoplasma y el núcleo de las células vivas.

A la luz de sus propiedades de hibridación y permeación celular potenciadas, también son útiles para enfoques terapéuticos, tales como los mediados por la degradación antisentido u de ARNsi del ARN mensajero, mediante salto de exones durante la maduración del ARN mensajero, mediante formación de triple hélice con cromatina, mediante invasión de hebra de cromatina (corrección génica) .

Por tanto, la invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad

eficaz de moléculas de oligonucleótido-oligocatión tal como se ha definido anteriormente, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

[0027 Por tanto, la invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de moléculas de oligonucleótido-oligocatión tal como se ha definido anteriormente, en asociación con un vehículo 45 farmacéuticamente aceptable.

Las moléculas mixtas oligonucleótido-oligocatión definidas anteriormente se sintetizan de forma ventajosa por etapas en un sintetizador de oligonucleótidos, mediante la vía de fosforoamidita, de acuerdo con un procedimiento que comprende

- introducir viales que contienen oligocationes activados y protegidos B en un sintetizador de oligonucleótidos, además de viales de los oligonucleótidos A como se ha definido anteriormente, o lo contrario,

- detener la síntesis cuando se obtiene la longitud deseada,

-escindir los oligómeros del soporte sólido, y 55 -eliminar los grupos protectores.

La invención está estrechamente relacionada con los reactivos de fosforoamidita usados en la síntesis automática para la construcción del bloque B con varios oligocationes. Los siguientes reactivos de fosforoamidita se pueden usar para este objetivo P (OR9) (N (R10) 2) -O-R1- (X-R2n) n1-X-R3-O-Prot, en la que R1, R2, R3, n y n1 son como 60 se ha definido anteriormente, X es NH o NC (NH2) 2 adecuadamente protegidos, R9 es -CH2CH2CN, o alquilo inferior, R10 es alquilo inferior o -N (R10) 2 es un grupo pirrolidino, piperidino o morfolino y Prot es un grupo protector usado en la síntesis de oligonucleótidos, tales como DMT, MMT; P (OR9) (N (R10) 2) -O-R4-CH (R5X1) -R6-O-Prot, en la que R4, R5, R6 son alquileno inferior, X1 es putrescina, espermidina o espermina protegidos adecuadamente, R9 y R10 como se ha definido correctamente... [Seguir leyendo]

1. Moléculas de oligonucleótido-oligocatión AiBjH que se pueden sintetizar mediante química de fosforoamidita automática Ai y restos oligocationes Bj, en los que . Ai es un residuo oligonucleotídico de i unidades, siendo i = 5 a 50 con bases nucleotídicas naturales o no naturales y/o grupos de pentafuranosilo y/o enlaces fosfodiéster nativos, así como sus modificaciones y sustituciones químicas, . Bj es un resto oligocatiónico orgánico de j unidades, siendo j = 1 a 50, en la que B se selecciona del grupo que consiste en • -HPO3-R1- (X-R2n) n1-X-R3-O-, en la que R1, R2 y R3, idénticos o diferentes, son alquileno inferior, X es NH o NC (NH2) 2, n varía de 1 a 5 y n1 = 2 a 20, • -HPO3-R4-CH (R5X1) -R6-O-, en la que R4 es alquileno inferior, R5 y R6, idénticos o diferentes, son alquileno inferior y X1 es putrescina, espermidina o residuo de espermina,

en el que el alquileno inferior es un radical alquileno C1-C5 lineal o ramificado opcionalmente sustituido.

2. Las moléculas de la reivindicación 1, en las que el oligonucleótido se selecciona en el grupo que comprende 20 desoxirribo, ribo, nucleótidos bloqueados (LNA) así como sus modificaciones o sustancias químicas.

3. Las moléculas de la reivindicación 2, en las que las modificaciones o sustituciones son fosforototioato.

2. flúor-2’O-alquilo o un agente fluorescente.

4. Las moléculas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tienen la secuencia 3'A5' – B.

5. Las moléculas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tienen la secuencia B - 3'A5'.

6. Las moléculas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tienen secuencias 3'A5' - B o 3'A5' B 3'A5' así 30 como sus combinaciones '.

7. Las moléculas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tienen siguiente estructura:

8. Un procedimiento para obtener moléculas de oligonucleótidos-oligocatión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, mediante el uso de una síntesis por etapas en un sintetizador de oligonucleótidos, por la vía de la fosforoamidita, que comprende:

- introducir viales que contienen oligocationes activados y protegidos B en un sintetizador de oligonucleótidos, 40 además de viales de los oligonucleótidos A, o lo contrario,

- detener la síntesis cuando se obtiene la longitud deseada,

- escindir los oligómeros del soporte sólido, y

- eliminar los grupos protectores.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los reactivos de fosforoamidita se seleccionan del grupo que consiste en:

• P (OR9) (N (R10) 2) -O-R1- (X-R2n) n1-X-R3-O-Prot, en la que R1, R2, R3, n y n1 son como se ha definido anteriormente, X es NH o NC (NH2) 2 adecuadamente protegidos, R9 es -CH2CH2CN, o alquilo inferior, R10 es 50 alquilo inferior o -N (R10) 2 es un grupo pirrolidino, piperidino o morfolino y Prot es un grupo protector usado en la síntesis de oligonucleótidos, tales como DMT, MMT;

• P (OR9) (N (R10) 2) -O-R4-CH (R5X1) -R6-O-Prot, en la que R4, R5, R6 son alquileno inferior, X1 es putrescina, espermidina o espermina protegidos adecuadamente, R9 y R10 como se ha definido en lo que antecede;

en el que el alquilo y el alquileno inferior son un radical alquileno C1-C5 lineal o ramificado opcionalmente sustituido.

10. El procedimiento de la reivindicación 8 o 9, en el que a la síntesis por etapas de la secuencia de oligonucleótidos le sigue la síntesis por etapas del resto oligocatión para obtener compuestos que tienen la secuencia (3'A5'- B) .

11. El procedimiento de la reivindicación 8 o 9, en el que a la síntesis por etapas del resto oligocatión le sigue la síntesis por etapas de la secuencia oligonucleotídica para obtener compuestos que tienen la secuencia (B -3'A5') .

12. El procedimiento de las reivindicaciones 8 o 9, que comprende la síntesis de secuencias mixtas.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la síntesis de secuencias oligonucleotídicas tapadas en ambos extremos (B -3'A5'- B) o las secuencias oligonucloeotídicas de catión interrumpida (3'A5'- B -3'A5') ..

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que los oligocationes B activados y

protegidos se obtienen protegiendo los grupos amino de una poliamina, seguido de hidroxialquilación a, w-bis, lo que conduce a dioles compatibles con la síntesis de oligonucleótidos.

15. Como compuestos intermedios, los reactivos de fosforoamidita P (OR9) (N (R10) 2) -O-R1- (X-R2n) n1-X-R3-O-Prot, en la que R1, R2, R3, n y n1 son como se ha definido anteriormente, X es NH o NC (NH2) 2 adecuadamente protegidos, R9 10 es -CH2CH2CN, o alquilo inferior, R10 es alquilo inferior o -N (R10) 2 es un grupo pirrolidino, piperidino o morfolino y Prot es un grupo protector usado en la síntesis de oligonucleótidos, tales como DMT, MMT; P (OR9) (N (R10) 2) -O-R4CH (R5X1) -R6-O-Prot, en la que R4, R5, R6 son alquileno inferior, X1 es espermidina o espermina, R3 y R10 son como se ha definido anteriormente, en el que el alquilo inferior y el alquileno inferior son un radical alquilo o alquileno sustituido, y como se ha definido anteriormente, el alquilo inferior y el alquileno inferior son radical alquilo o alquileno C1-C5 y un radical alquilo ramificado o un radical alquileno, respectivamente.

16. Uso de una molécula de oligonucleótido-oligocatión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en diagnóstico.

17. Uso de una molécula de oligoonucleótido-oligocatión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en PCR, en PCR en tiempo real, genotipado, hibdridación in situ.

18. Uso de una molécula de oligonucleótido-oligocatión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricación de circuitos de ADN.

19. Composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de moléculas de oligonucleótido-oligocatión de acuerdo con una cualquiera de as reivindicaciones 1 a 7, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10a Figura 11 Figura 12A Figura 13 Figura 14