Nuevos genes de resistencia a los herbicidas.

Un polinucleótido aislado que codifica una proteína dotada de actividad dioxigenasa dependiente de alfacetoglutarato,

en que una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína hibrida en condiciones restrictivascon la secuencia complementaria completa de una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEC ID nº 5,SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4, en que dicho polinucleótido está ligado operativamente a un promotor que es funcionalen una célula vegetal.

Nuevos genes de resistencia a los herbicidas.

Antecedentes de la invención Las malas hierbas pueden privar al suelo con rapidez de los nutrientes que los cultivos y otras plantas útiles necesitan, y para mantenerlas bajo control se recurre a una multitud de herbicidas distintos; uno de los más utilizados es el glifosato.

Diversos cultivos como el maíz, soja, canola, algodón, remolacha azucarera, trigo, arroz y césped, han sido desarrollados para convertirlos en resistentes al glifosato. Así, por ejemplo, es posible sembrar los campos con maíz resistente al glifosato para mantener a raya las malas hierbas sin causar daños importantes a las plantas de maíz.

A mediados de los años 90, gracias a las técnicas de ingeniería genética surgieron los cultivos tolerantes al glifosato (GTC, por sus siglas en inglés) : con ellos los cultivadores tuvieron a su disposición una herramienta sencilla, cómoda, flexible y asequible para controlar una amplia gama de malas hierbas latifolias y gramíneas, nunca vista en agricultura. Los productores adoptaron rápidamente los GTC y, en muchos casos, abandonaron muchas de las mejores prácticas agronómicas como la rotación de cultivos, la rotación en el mecanismo de acción del herbicida, el uso de mezclas en tanque y la incorporación del control mecánico al control de las malas hierbas por medios químicos y culturales. En la actualidad, en Estados Unidos y en otros países del hemisferio occidental se pueden adquirir variedades comerciales tolerantes al glifosato de soja, algodón, maíz y canola, y otros cultivos GTC (trigo, arroz, remolacha azucarera, césped, etc.) permanecen sin comercializar a la espera de ganar aceptación en el mercado mundial. Muchas otras especies resistentes al glifosato se encuentran en fase de experimentación o desarrollo (entre otras, alfalfa, caña de azúcar, girasol, remolachas, guisantes, zanahoria, pepino, lechuga, cebolla, fresa, tomate y tabaco; especies forestales como el chopo y el árbol del ámbar; y especies de horticultura ornamental como tagetes, petunias y begonias. Véase el sitio web isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm, 2005) . Por si todo esto no bastara, el coste del glifosato ha disminuido drásticamente en los últimos años, hasta el punto de que son muy pocos los programas convencionales para el control de las malas hierbas que pueden competir en precio y rendimiento con los sistemas de GTC basados en el glifosato.

El glifosato viene siendo utilizado con éxito desde hace más de 15 años en el desherbado químico de los campos y en otras aplicaciones no agrícolas como medio de control total de la vegetación. En muchos casos, como sucede con los GTC, ha sido utilizado 1-3 veces al año durante 3, 5, 10 y hasta 15 años seguidos. Tal proceder ha propiciado una excesiva dependencia del glifosato y de la tecnología de GTC que ha generado una gran presión selectiva en la flora arvense autóctona en favor de las plantas que de forma natural son más tolerantes a él o que han logrado desarrollar un mecanismo de resistencia a su acción herbicida.

El uso generalizado de los programas de control de malas hierbas basados exclusivamente en el glifosato está provocando la selección de variedades resistentes al mismo y facilitando la propagación de las malezas que son más tolerantes que la mayoría de las especies diana; en otras palabras, está generando cambios en la flora arvense. (Ng et al., 2003; Simarmata et al., 2003; Lorraine-Colwill et al., 2003; Sfiligoj, 2004; Miller et al., 2003; Heap, 2005; Murphy et al., 2002; Martin et al., 2002) . Con todo, a pesar del amplio uso del glifosato en todo el mundo durante más de 15 años, hasta el momento son contadas las malas hierbas en las que se ha detectado resistencia (Heap, 2005) ; la mayoría de casos se han descubierto durante los últimos 3-5 años. Entre las malas hierbas resistentes se encuentran tanto gramíneas como latifolias: Lolium rigidum, Lolium multiflorum, Eleusine indica, Ambrosia artemisiifolia, Conyza canadensis, Conyza bonariensis y Plantago lanceolata. Asimismo, malezas que no habían supuesto problema alguno hasta el uso generalizado de los GTC están adquiriendo cada vez más prevalencia y resultan más difíciles de controlar en el contexto de los GTC, que abarca más del 80% de la superficie cultivada de algodón y soja en Estados Unidos y más del 20% de la superficie dedicada al maíz en ese mismo país (Gianessi, 2005) . Tales cambios en la flora arvense atañen predominantemente, aunque no en exclusiva, a especies latifolias de difícil control como por ejemplo Ipomoea, Amaranthus, Chenopodium, Taraxacum y Commelina.

En aquellas zonas donde los cultivadores se enfrentan a malas hierbas resistentes al glifosato o a un cambio en la flora arvense favorable a las especies de más difícil control, es posible compensar la pérdida de eficacia del glifosato mezclándolo en el tanque o alternándolo con otros herbicidas capaces de controlar las malas hierbas “descarriadas”. Un compatible en tanque eficaz y muy utilizado para el control de las latifolias recalcitrantes es el ácido 2, 4diclorofenoxiacético (2, 4-D) . El 2, 4-D se emplea desde hace más de 60 años en agricultura y en otras disciplinas como herbicida de amplio espectro contra las malas hierbas latifolias y, a pesar de que se han descrito casos esporádicos de tolerancia, sigue siendo uno de los herbicidas más utilizados en el mundo. No obstante, una desventaja que limita su uso es su escasa selectividad en cultivos de dicotiledóneas como la soja o el algodón, motivo por el cual no suele aplicarse a cultivos de dicotiledóneas sensibles, ni siquiera en las proximidades de los mismos. Por otra parte, su empleo en los cultivos de cereales se ve limitado por la naturaleza de los daños que puede ocasionar. La combinación de 2, 4-D y glifosato ha sido utilizada como un potente tratamiento de desherbado químico antes de la siembra sin laboreo de la soja y el algodón, aunque debido a la sensibilidad de ambas dicotiledóneas al 2, 4-D, este tipo de tratamientos debe ser aplicado al menos entre 14 y 30 días antes de la

plantación (Agriliance, 2003) .

El 2, 4-D pertenece a los herbicidas derivados del ácido fenoxi, como MCPA, mecoprop y diclorprop. Ha sido utilizado en muchos cultivos de monocotiledóneas (maíz, trigo y arroz, entre otros) para el control selectivo de las malas hierbas de hoja ancha sin dañar gravemente a las plantas del cultivo. El 2, 4-D es un derivado auxínico sintético que actúa desregulando la homeostasis normal entre la célula y las hormonas e impide un crecimiento equilibrado y controlado; su mecanismo de acción no se conoce con exactitud.

El 2, 4-D presenta diferentes grados de selectividad en ciertas plantas, de tal modo que las dicotiledóneas son más sensibles a él que las gramíneas. Las diferencias en el metabolismo del 2, 4-D entre plantas distintas explican en parte los grados de selectividad. En general, las plantas lo metabolizan lentamente, de modo que las diferencias observadas en la respuesta de las plantas al mismo probablemente puedan explicarse por la actividad sobre el o los sitios diana (WSSA, 2002) . La metabolización del 2, 4-D en la planta suele acaecer en dos fases: hidroxilación seguida de la conjugación con aminoácidos o glucosa (WSSA, 2002) .

Con el paso del tiempo, los microbios del suelo han desarrollado una vía alternativa y eficaz para degradar el 2, 4-D, lo que desemboca en la completa mineralización de este xenobiótico. Las reiteradas aplicaciones del herbicida seleccionan a los microbios que son capaces de emplearlo como fuente de carbono para crecer, atributo que les confiere una ventaja competitiva en el suelo. Por esta razón, actualmente el 2, 4-D se formula para tener una vida media relativamente breve en el suelo, sin que se hayan detectado efectos residuales destacables en los cultivos ulteriores. Ello supone una ventaja añadida a su acción herbicida.

Un microorganismo ampliamente estudiado por su capacidad para degradar el 2, 4-D es Ralstonia eutropha (Streber et al., 1987) . El gen que codifica a la responsable de la primera reacción enzimática en la vía de mineralización del 2, 4-D es el tfdA. Véase la Patente U.S. N.º 6.153.401 y el N.º de entrada M16730 del Genbank. El tfdA cataliza la transformación del ácido 2, 4-D en diclorofenol (DCP) a través de una reacción mediada por una dioxigenasa dependiente de a-cetoglutarato (Smejkal et al., 2001) . El DCP posee una escasa actividad herbicida en comparación con el 2, 4-D. El gen tfdA se ha insertado en dicotiledóneas sensibles (p. ej., algodón y tabaco) para crear plantas transgénicas resistentes al 2, 4-D (Streber et al. (1989) , Lyon et al. (1989) , Lyon (1993) y Patente U.S. N.º 5.608.147) .

En el medio ambiente se ha identificado... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado que codifica una proteína dotada de actividad dioxigenasa dependiente de alfacetoglutarato, en que una molécula de ácido nucleico que codifica dicha proteína hibrida en condiciones restrictivas con la secuencia complementaria completa de una secuencia seleccionada del grupo consistente en SEC ID nº 5, SEC ID nº 3 y SEC ID nº 4, en que dicho polinucleótido está ligado operativamente a un promotor que es funcional en una célula vegetal.

2. Polinucleótido de la reivindicación 1, en que dicho polinucleótido comprende una preferencia codónica que lo optimiza para la expresión en una planta, preferiblemente una planta dicotiledónea o una planta monocotiledónea.

3. Polinucleótido de la reivindicación 1, en que dicho polinucleótido codifica la proteína dotada de actividad dioxigenasa dependiente de alfa-cetoglutarato R-específica respecto a un herbicida 2, 4-D.

4. Polinucleótido de la reivindicación 1, en que dicho polinucleótido comprende la SEC ID nº 5.

5. Polinucleótido de la reivindicación 1, en que dicho promotor es un promotor vegetal o de origen viral, preferiblemente un promotor del virus del mosaico de las nervaduras de mandioca.

6. Método para seleccionar una célula vegetal transformada, en que dicho método comprende someter una pluralidad de células vegetales a transformación con un polinucleótido de la reivindicación 1 y cultivar dichas células con una concentración de un herbicida que permita a las células transformadas que expresan dicho polinucleótido crecer y, al mismo tiempo, matar o inhibir el crecimiento de las células no transformadas, en que dicho herbicida es seleccionado del grupo consistente en un auxínico fenoxi y un ariloxifenoxialcanoato.

7. Método para detectar si una planta contiene un polinucleótido de la reivindicación 1, en que dicho método comprende la recogida de una muestra de dicha planta y el análisis de dicha muestra para determinar la presencia de dicho polinucleótido.

8. Método de la reivindicación 7, en que dicho método comprende el análisis de dicha muestra para determinar la presencia de una proteína codificada por dicho polinucleótido.

9. Método de la reivindicación 7, en que dicho método comprende el uso de un cebador o sonda de PCR para detectar la presencia de dicho polinucleótido.

10. Método de la reivindicación 8, en que dicho método comprende el uso de un anticuerpo para detectar la presencia de dicha proteína.