Moléculas de unión.

Un complejo de polipéptido de unión que consiste en un dímero de una primera cadena pesada y una segundacadena pesada en el que:

cada cadena pesada comprende dos dominios de unión VH ligados por un dominio de dimerización;

y cada dominio de dimerización comprende al menos dominios constantes de anticuerpos de cadena CH2, CH3

y opcionalmente CH4 de cualquier clase de gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina.

Moléculas de unión

Campo de la invención La presente invención se refiere a la fabricación de un diverso repertorio de anticuerpos solo de cadena pesada funcionales que se someten a maduración por afinidad, y usos de los mismos. La invención también se refiere a la fabricación y uso de un diverso repertorio de anticuerpos solo de cadena pesada específicos de clase y a la fabricación y uso de complejos de polipéptido multivalentes con funcionalidad de la cadena pesada del anticuerpo, preferentemente funcionalidad de unión de la cadena pesada del anticuerpo, actividad efectora de la región constante y, opcionalmente, funciones efectoras adicionales.

La presente invención también se refiere a un procedimiento de generación de anticuerpos solo de cadena pesada completamente funcionales en ratones transgénicos en respuesta a exposición a antígeno. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la generación de anticuerpos solo de cadena pesada de alta afinidad específicos de antígeno humano de cualquier clase, o mezcla de clases, y el aislamiento y expresión de dominios de unión a antígeno de VH completamente funcional.

La presente invención también se refiere a la generación de complejos de polipéptido multivalentes que comprenden funcionalidad de la cadena pesada, preferentemente actividad efectora de la cadena pesada y otras funciones de unión y efectoras.

También se describen anticuerpos solo de cadena pesada y otros complejos de unión multivalentes generados usando los procedimientos de la presente invención y divulgación y usos de los mismos.

Antecedentes a la invención Los anticuerpos monoclonales o variantes de los mismos representarán una alta proporción de nuevas medicinas lanzadas en el siglo XXI. La terapia con anticuerpos monoclonales ya se ha aceptado como una vía preferida para el tratamiento de artritis reumatoide y enfermedad de Crohn y hay un impresionante progreso en el tratamiento de cáncer. Los productos basados en anticuerpos también están en desarrollo para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares e infecciosas. La mayoría de los productos de anticuerpos monoclonales comercializados reconocen y se unen a un único epítope bien definido sobre el ligando diana (por ejemplo, TNFa) . La fabricación de anticuerpos monoclonales humanos para terapia sigue dependiendo del cultivo celular de mamífero. El ensamblaje de un complejo que consiste en dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (el complejo H2L2) y posteriores procedimientos de glucosilación postraduccional excluye el uso de sistemas bacterianos. Los costes de producción y los costes de capital para la fabricación de anticuerpos por cultivo celular de mamífero son altos y amenazan con limitar el potencial de las terapias basadas en anticuerpos en ausencia de alternativas aceptables. Una variedad de organismos transgénicos pueden expresar anticuerpos completamente funcionales.Éstos incluyen plantas, insectos, pollos, cabras y ganado vacuno, pero ninguno se ha usado hasta ahora para fabricar productos terapéuticos comercializados.

Los fragmentos de anticuerpos funcionales pueden fabricarse en E. coli, pero el producto tiene generalmente baja estabilidad en suero, a menos que se PEGile durante el procedimiento de fabricación.

Los complejos de anticuerpo biespecífico son moléculas basadas en Ig manipuladas que pueden unir dos epítopes diferentes sobre tanto el mismo antígeno como sobre antígenos diferentes. Las proteínas de unión biespecíficas que incorporan anticuerpos solos o en combinación con otros ligantes son prometedoras para las modalidades de tratamiento en las que funciones inmunes humanas capturadas provocan un efecto terapéutico, por ejemplo, la eliminación de patógenos (Van Spriel y col., (1999) J. Infect. Diseases, 179, 661-669; Tacken y col., (2004) J. Immunol., 172, 4934-4940; documento US 5.487.890) , el tratamiento de cáncer (Glennie y van der Winkel, (2003) Drug Discover y Today, 8, 503-5100) ; e inmunoterapia (Van Spriel y col., (2000) Immunol. Today, 21, 391-397; Segal y col., (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6; Ly den y col., (2001) Nat. Med., 7, 1194-1201) .

Los asuntos de fabricación se agravan cuando un producto de anticuerpo biespecífico se basa en dos o más complejos de H2L2. Por ejemplo, la co-expresión de dos o más conjuntos de genes de la cadena pesada y ligera puede producir la formación de hasta 10 combinaciones diferentes, solo una de las cuales es el heterodímero deseado (Suresh y col., (1986) Methods Enzymol., 121, 210-228) .

Para tratar este asunto se han desarrollado varias estrategias para la producción en células de mamífero de formatos de IgG biespecíficas de longitud completa (BsIgG) que retienen la función efectora de la cadena pesada. Las BsIgG requieren cadenas pesadas de “botón y ojal” manipuladas para prevenir la formación de heterodímeros y utilizar cadenas L idénticas para prevenir el apareamiento erróneo de cadenas L (Carter, (2001) J. Immunol. Methods, 248, 7-15) . También se han descrito estrategias de reticulación química alternativas para la producción de complejos de fragmentos de anticuerpos que reconocen cada uno diferentes antígenos (Ferguson y col., (1995) Arthritis and Rheumatism, 38, 190-200) o la reticulación de otras proteínas de unión, por ejemplo, colectinas, a fragmentos de anticuerpos (Tacken y col., (2004) J. Immunol., 172, 4934-4940) .

El desarrollo de diacuerpos o minianticuerpos (BsAb) que generalmente carecen de funciones efectoras de lacadena pesada también supera la redundancia de heterodímeros. Éstos comprenden anticuerpos monocatenarios mínimos que incorporan sitios de unión VH y VL (scFv) que posteriormente se pliegan y dimerizan para formar un anticuerpo biespecífico divalente monovalente para cada uno de sus antígenos diana (Holliger y col., (1993) PNAS, 90, 6444-6448; Muller y col., (1998) FEBS Lett., 422, 259-264) . En un caso, los dominios constantes CH1 y L se han usado como dominios de heterodimerización para la formación de mini-anticuerpos bi-específicos (Muller y col., (1998) FEBS Lett., 259-264) . Se ha desarrollado una variedad de procedimientos recombinantes basados en sistemas de expresión en E. coli para la producción de BsAb (Hudson, (1999) Curr. Opin. Immunol., 11, 548-557) , aunque parecería que el coste y escala de producción del material de anticuerpo multivalente de calidad clínica sigue siendo el impedimento primario para el desarrollo clínico (Segal y col., (2001) J. Immunol. Methods, 248, 1-6) .

Recientemente, el concepto de BsAb se ha extendido para englobar di-diacuerpos, anticuerpos biespecíficos tetravalentes en los que los dominios VH y VL en cada cadena H y L se han sustituido por pares manipulados de dominios de unión scFv. Tales construcciones, aunque son complejas de manipular, pueden ensamblarse en células de mamífero en cultivo en ausencia de redundancia de hetero-dímeros (Lu y col., (2003) J. Immunol. Methods, 279, 219-232) .

La estructura de inmunoglobulinas es muy conocida en la técnica. La mayoría de las inmunoglobulinas naturales comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas se unen entre sí mediante enlaces disulfuro entre dominios bisagra localizados aproximadamente a mitad de camino a lo largo de cada cadena pesada. Una cadena ligera está asociada a cada cadena pesada en el lado del extremo N del dominio bisagra. Cada cadena ligera está normalmente unida a su cadena pesada respectiva por un enlace disulfuro próximo al dominio bisagra.

Cuando una molécula de Ig está correctamente plegada, cada cadena se pliega en varios dominios globulares distintos unidos por una secuencia de polipéptidos más lineal. Por ejemplo, la cadena ligera se pliega en un dominio variable (VL) y uno constante (CL) . Las cadenas pesadas tienen un único dominio variable VH, adyacente al dominio variable de la cadena ligera, un primer dominio constante, un dominio bisagra y dos o tres dominios constantes adicionales. La interacción de los dominios variables de la cadena pesada (VH) y ligera (VL) produce la formación de una región de unión a antígeno (Fv) . Generalmente, se requieren tanto VH como VL para la unión a antígeno, aunque se ha mostrado que dímeros de cadenas pesadas y fragmentos del extremo amino retienen actividad en ausencia de cadena ligera (Jaton y col., (1968) Biochemistr y , 7, 4185-4195) .

Con la aparición de nuevas técnicas de biología molecular, la presencia de anticuerpo solo de cadena pesada (que carece de cadena ligera) se identificó en trastornos proliferativos de linfocitos B en el hombre (enfermedad de la cadena pesada) y en sistemas de modelo murino. El análisis de la enfermedad de la cadena pesada... [Seguir leyendo]

1. Un complejo de polipéptido de unión que consiste en un dímero de una primera cadena pesada y una segunda cadena pesada en el que:

cada cadena pesada comprende dos dominios de unión VH ligados por un dominio de dimerización; y cada dominio de dimerización comprende al menos dominios constantes de anticuerpos de cadena CH2, CH3 y opcionalmente CH4 de cualquier clase de gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina.

2. Un complejo de polipéptido de unión de la reivindicación 1, en el que los dominios de unión VH presentes en los extremos amino de la primera y segunda cadena pesada son idénticos, y los dominios de unión VH presentes en los extremos carboxilo de la primera y segunda cadenas pesadas son idénticos.

3. Un complejo de polipéptido de unión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los dominios de unión VH pueden derivarse de dominios de unión VH naturales que incluyen dominios de unión VHH de camélido, o dominios de unión VH modificados de cualquier vertebrado.

4. El complejo de polipéptido de unión de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los dominios VH son dominios VH humanos.

5. Un polinucleótido aislado que codifica ambas cadenas pesadas de un complejo de unión de polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de clonación o de expresión que contiene polinucleótido aislado de la reivindicación 5 que codifica la primera y segunda cadenas pesadas.

7. Una célula huésped transformada con un vector de expresión de la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para la producción de un complejo de polipéptido de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 7 y aislar el complejo de polipéptido de unión.

9. Una composición del complejo de polipéptido de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un vehículo farmacológicamente apropiado.

10. El complejo de polipéptido de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o la composición de la reivindicación 9, para su uso en terapia.

11. El complejo de polipéptido de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en diagnosticar una enfermedad.