Métodos y composiciones para someter a ensayo la homocisteina.

Método para someter a ensayo la homocisteína (Hcy) en una muestra sin separación cromatográfica,

comprendiendo el método:

a) poner en contacto una muestra que contiene o que se sospecha que contiene Hcy, con un cosustrato de Hcyun enzima conversor de Hcy en una reacción de conversión de Hcy para formar un producto de conversión deHcy y un producto de conversión de cosustrato de Hcy, en el que el cosustrato de Hcy es la S-adenosilmetionina(SAM), el enzima conversor de Hcy es la homocisteína S-metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina(SAM), el producto de conversión de Hcy es la metionina (Met) y el producto de conversión de cosustrato de Hcyes la S-adenosil-L-homocisteína (SAH),

b) poner en contacto la mezcla con una adenosilhomocisteína nucleosidasa para convertir SAH en adenina y Sribosil-homocisteína,

c) poner en contacto la mezcla con una S-ribosil-homocisteinasa para ciclar la S-ribosil-homocisteína enhomocisteína, y

d) evaluar la cantidad de adenina en la muestra,

en la que la cantidad de Hcy en la muestra se determina a partir de la cantidad de adenina.

Métodos y composiciones para someter a ensayo la homocisteína CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere de manera general al campo de la detección de la homocisteína. En particular, la invención proporciona un método para determinar la presencia o concentración de homocisteína (Hcy) en muestras en las que la homocisteína reacciona con un cosustrato de Hcy en una reacción de conversión de Hcy catalizada por un enzima conversor de Hcy para formar un producto de conversión de Hcy y un producto de conversión de cosustrato de Hcy, y el producto de conversión de cosustrato de Hcy se evalúa para determinar la presencia y/o concentración de Hcy en la muestra. El cosustrato de Hcy puede evaluarse directamente o puede convertirse adicionalmente en otro u otros materiales antes de realizar la evaluación. Se proporciona además un kit para someter a ensayo la homocisteína basado en el mismo principio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La concentración total de homocisteína en los líquidos corporales tales como el plasma o el suero es un marcador importante de enfermedad. Por ejemplo la cuantificación de la homocisteína puede ser un importante indicador de riesgo de enfermedad cardiovascular, puede ser un marcador sensible de deficiencias en cobalamina y folato, y puede utilizarse para diagnosticar errores innatos del metabolismo conocidos como homocistinuria. Se ha informado también que la cuantificación de la homocisteína resulta útil para evaluar defectos de nacimiento en mujeres gestantes y alteraciones cognitivas en personas de edad avanzada. Ver Frantzen et al., Enzyme Conversion Immunoassay for Determining Total Homocysteine in Plasma or Serum, Clinical Chemistr y 44 (2) :311-316, 1998.

La homocisteína (Hcy) es un aminoácido que contiene tiol formado a partir de metionina durante las reacciones de transmetilación dependientes de S-adenosilmetionina. La Hcy intracelular se remetila formando metionina, o se cataboliza irreversiblemente en una serie de reacciones, formando cisteína. La Hcy intracelular se exporta a los líquidos extracelulares, tales como la sangre y la orina, y circula mayoritariamente en forma oxidada y principalmente unida a proteínas plasmáticas (Refsum et al., Annu. Rev. Medicine 49:31-62, 1998) . La cantidad de Hcy en el plasma y en la orina refleja el equilibrio entre la producción y la utilización de Hcy. Este equilibrio puede resultar perturbado en estados clínicos caracterizados por trastornos genéticos de enzimas que participan en la transsulfuración y remetilación de la Hcy (por ejemplo la cistatión º -sintasa y la N5, 10-metilentetrahidrofolato reductasa o en la deficiencia en la dieta de vitaminas (por ejemplo las vitaminas B6, B12 y folato) que participan en el metabolismo de la Hcy (Baual et al., Cleveland Clinic Journal of Medicine 64:543-549, 1997) . Además, los niveles plasmáticos de Hcy también pueden resultar perturbados por algunas medicaciones, tales como los fármacos antifolato (por ejemplo el metotrexato) utilizados para el tratamiento del cáncer o la artritis (Foody et al., Clinician Reviews 8:203-210, 1998) .

Algunos casos severos de homocisteinemia son provocados por defectos homocigóticos en genes codificantes de enzimas participantes en el metabolismo de la Hcy. En estos casos, un defecto en un enzima que participa en la remetilación o trans-sulfuración de la Hcy conduce a elevaciones de hasta 50 veces en el nivel de Hcy en la sangre y orina. La forma clásica de dicho trastorno, la homocisteinemia congénita (Hcyemia) está causada por defectos homocigóticos en el gen codificante de la cistatión º-sintasa (CBS) . Estos individuos sufren complicaciones tromboembólicas a edad temprana, resultando en ictus, infarto de miocardio, hipertensión renovascular, claudicación intermitente, isquemia mesentérica y embolismo pulmonar. Dichos pacientes también pueden manifestar retardo mental y otras anormalidades, similares a ectopia lentis y deformidades esqueléticas (Perr y T., Homocysteine: Selected aspects in Nyham W.L. ed. Heritable disorders of amino acid metabolism. New York, John Wiley & Sons, páginas 419-451, 1974) . También es conocido que los niveles elevados de Hcy en mujeres gestantes se relacionan con defectos de nacimiento de niños con cierre del tubo neural (Scott, et al., "The etiology of neural tube defects" in Graham, I., Refsum, H., Rosenberg, I.H., and Ureland P.M. ed. "Homocysteine metabolism: from basic science to clinical medicine" Kluwer Academic Publishers, Boston, páginas 133-136, 1995) . De esta manera, la utilidad diagnóstica de las determinaciones de Hcy ha sido bien documentada en dichas condiciones clínicas.

Se ha demostrado que niveles incluso leve o moderadamente elevados de Hcy también incrementan el riesgo de ateroesclerosis de las arterias coronarias, cerebrales y periféricas, y enfermedades cardiovasculares (Boushey et al., JAMA 274:1049-1057, 1995) . Se ha demostrado que la prevalencia de Hcyemia es de 42%, 28% y 30% entre pacientes con enfermedad cerebral vascular, enfermedad vascular periférica y enfermedad cardiovascular, respectivamente (Moghadasian et al., Arch. Intern. Med. 157:2299-2307, 1997) . Una metaanálisis de 27 estudios clínicos ha calculado que cada incremento de 5 mM del nivel de Hcy incrementa el riesgo de enfermedad arterial coronaria en 60% en hombres y en 80% en mujeres, lo que equivale a un incremento de 20 mg/dl-1 (0, 5 mmoles/dl) de colesterol plasmático, sugiriendo que la Hcy como factor de riesgo es tan potente como el colesterol en la población general. Los resultados de dichos estudios clínicos concluyeron que la hiperhomocisteinemia es un nuevo factor de riesgo independiente emergente de enfermedad cardiovascular y que podría explicar la mitad de aquellos pacientes cardiovasculares que no presentan ninguno de los factores de riesgo cardiovascular establecidos (por ejemplo hipertensión, hipercolesterolemia, tabaquismo, diabetes mellitus, obesidad marcada e inactividad física) .

La homocisteinemia leve está causada principalmente por la heterocigosidad de los defectos enzimáticos. Un polimorfismo habitual en el gen de la metilentetrahidrofolato reductasa aparentemente influye sobre la sensibilidad de los niveles de homocisteína a la deficiencia de ácido fólico (Boers et al., J. Inher. Metab. Dis. 20:301-306, 1997) . Además, los niveles plasmáticos de homocisteína también se encuentran significativamente incrementados en los pacientes de trasplante cardiaco y renal (Ueland et al., J. Lab. Clin. Med. 114:473-501, 1989) , en pacientes de Alzheimer (Jacobsen et al., Clin. Chem. 44:2238-2239, 1998) , así como en pacientes de diabetes mellitus no dependiente de insulina (Ducloux et al., Nephrol. Dial. Transplantl. 13:2890-2893, 1998) . La acumulación de datos que relacionan los niveles elevados de homocisteína con la enfermedad cardiovascular ha motivado el inicio de ensayos clínicos multicentro de doble ciego, aleatorizados y controlados con placebo para demostrar la eficacia de la reducción del nivel plasmático de Hcy en la prevención o detención del progreso de las enfermedades vasculares (Diaz-Arrastia et al., Arch. Neurol. 55:1407-1408, 1998) . La determinación de los niveles plasmáticos de homocisteían debería ser una práctica clínica habitual.

Como factor de riesgo de enfermedad cardiovascular se ha recomendado en el contexto clínico la determinación de los niveles plasmáticos totales de Hcy (reducida, oxidada y unida a proteína) (Hornberger et al., American J. of Public Health 88:61-67, 1998) . Desde 1982 se han descrito varios métodos para determinar el nivel plasmático total de Hcy (Mansoor et al., Anal. BioChem. 200:-218-229, 1992; Steir et al., Arch. Intern. Med. 158:1301-1306, 1998; Ueland et al., Clin. Chem. 39: 1764-1779, 1993, y Ueland et al., "Plasma homocysteine and cardiovascular disease", en Francis, R.B.Jr. editores, Atherosclerotic Cardiovascular Disease, Hemostasis, and Endothelial Function, New York, Marcel Dokker, páginas 183-236, 1992, y ver también Ueland et al., "Plasma homocysteine and cardiovascular disease", en Francis, R.B.Jr. editores, Atherosclerotic Cardiovascular Disease, Hemostasis, and Endothelial Function, New York, Marcel Dokker, páginas 183-236, 1992) . El ensayo de la Hcy total en plasma o suero se ve complicado por el hecho de que el 70% de la Hcy plasmática se encuentra unida a proteínas y 20% a 30% existe en forma de mezcla de disulfuros libres simétricos o mayoritariamente asimétricos. La Hcy reducida libre existe únicamente en cantidades residuales (Stehouwer et al., Kidney International 55:308-314, 1999) .

La mayoría de los métodos requiere sofisticadas técnicas cromatográficas, tales como HPLC, cromatografía de gases capilar o espectrometría de masas (CG/EM) para medir directa o indirectamente... [Seguir leyendo]

1.Método para someter a ensayo la homocisteína (Hcy) en una muestra sin separación cromatográfica,

comprendiendo el método:

a) poner en contacto una muestra que contiene o que se sospecha que contiene Hcy, con un cosustrato de Hcy

un enzima conversor de Hcy en una reacción de conversión de Hcy para formar un producto de conversión de Hcy y un producto de conversión de cosustrato de Hcy, en el que el cosustrato de Hcy es la S-adenosilmetionina (SAM) , el enzima conversor de Hcy es la homocisteína S-metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina (SAM) , el producto de conversión de Hcy es la metionina (Met) y el producto de conversión de cosustrato de Hcy

es la S-adenosil-L-homocisteína (SAH) ,

b) poner en contacto la mezcla con una adenosilhomocisteína nucleosidasa para convertir SAH en adenina y S

ribosil-homocisteína,

c) poner en contacto la mezcla con una S-ribosil-homocisteinasa para ciclar la S-ribosil-homocisteína en homocisteína, y

d) evaluar la cantidad de adenina en la muestra,

en la que la cantidad de Hcy en la muestra se determina a partir de la cantidad de adenina.

2.Método según la reivindicación 1, en el que la adenina es convertida por la adenina desaminasa en amonio e hipoxantina, y se evalúa por lo menos uno de entre amonio e hipoxantina.

3.Método según la reivindicación 2, en el que la cantidad de amonio formado se mide mediante evaluación de la aparición de NAD+ o la desaparición de NADH al ser convertido el amonio en glutamato por la acción de la glutamato deshidrogenasa.

4.Método según la reivindicación 2, en el que se evalúa la hipoxantina mediante seguimiento de su conversión en xantina, estando catalizada la conversión por la xantina oxidasa.

5.Método según la reivindicación 1, en el que la adenina se evalúa mediante seguimiento de la formación de AMP y difosfato o ambos, catalizada por la acción de la adenina fosforibosiltransferasa actuando sobre la adenina y el 5fosfo-a-D-ribosa 1-difosfato (PRPP) .

6.Método según la reivindicación 1, en el que la muestra es un líquido corporal o un tejido biológico.

7.Método según la reivindicación 6, en el que el líquido corporal es sangre.

8.Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la SAM es producida a partir de ATP y metionina por una SAM sintasa.

9.Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que previamente o concurrentemente al contacto entre la muestra y el cosustrato de Hcy con el enzima conversor de Hcy, la Hcy oxidasa o conjugada en la muestra se convierte en Hcy reducida.

10.Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que, en la etapa b) la mezcla se pone en contacto con una S-adenosilhomocisteína nucleosidasa y con una S-ribosil-homocisteinasa para generar Hcy, que es ciclada en la reacción de conversión de Hcy por la homocisteína S-metiltransferasa dependiente de SAM para formar un sistema de reacción de ciclado enzimático basado en cosustrato de Hcy, y en el que tras dicha etapa b) sigue la etapa c) , en la que se evalúa la adenina formada con el fin de evaluar la presencia o cantidad de Hcy en la muestra.

11.Método según la reivindicación 10, en el que la evaluación de la adenina no implica una reacción enzimática generadora de H2O2 y la detección de H2O2.

12.Kit para someter a ensayo Hcy en una muestra, comprendiendo el kit:

a) una homocisteína S-metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina (SAM) ,

b) S-adenosilmetionina (SAM) o ATP, metionina y una SAM sintasa,

c) una SAH nucleosidasa, y

d) un reactivo para evaluar la adenina.

13.Kit según la reivindicación 12, en el que el reactivo para evaluar la adenina es una adenina desaminasa o una adenina fosforibosiltransferasa.

14.Kit según la reivindicación 12, que comprende además S-ribosil-homocisteinasa.

15.Kit para someter a ensayo Hcy en una muestra, comprendiendo el kit: a) una homocisteína S-metiltransferasa dependiente de S-adenosilmetionina (SAM) , b) S-adenosilmetionina (SAM) , o ATP, metionina y una SAM sintasa, y c) un reactivo para evaluar la adenina,

en el que el kit no comprende un enzima o un reactivo para generar H2O2 y un reactivo para detectar H2O2.