Métodos para modular receptores de superficie celular para prevenir o reducir la inflamación.

Un método para determinar el efecto anti-inflamatorio de un agente que comprende poner en contacto la célulacon el agente en presencia de una bacteria perjudicial o parte de dicha bacteria y detectar la presencia de uncompuesto indicador,

donde la ausencia sustancial de un material indicador significa que el agente es un agente anti-inflamatorio.

Métodos para modular receptores de superficie celular para prevenir o reducir la inflamación

Antecedentes de la invención Se sabe que los tejidos blandos de la cavidad oral de los mamíferos muestran las indicaciones más tempranas de inflamación. Este bajo nivel generalizado de inflamación puede conducir a gingivitis y/o periodontitis. Generalmente se cree que dicha inflamación es el resultado, al menos en parte, de las bacterias presentes en la cavidad oral. Además, la inflación del tejido oral puede estar causada por cirugía, lesión localizada, traumatismo, necrosis, higiene oral inapropiada o diversos orígenes sistémicos.

Generalmente se cree que los componentes celulares implicados por estas enfermedades y afecciones incluyen el tejido epitelial, los fibroblastos gingivales, y los leucocitos en circulación, todos los cuales contribuyen a la respuesta del hospedador a factores patogénicos generados por las bacterias. Se conocen algunos patógenos bacterianos implicados en estas infecciones orales aunque muchos pueden seguir siendo desconocidos o sin caracterizar. Aunque la infección por ciertos tipos de bacterias a menudo es el acontecimiento etiológico en muchas de estas enfermedades orales, la patogénesis de la enfermedad o afección está mediada por la respuesta del hospedador. El uso de agentes anti-bacterianos reduce la población bacteriana de una cavidad oral dada y pueden provocar una reducción de la inflamación. Sin embargo, este enfoque es desventajoso ya que dicha eliminación se consigue de forma indiscriminada (pueden perecer tanto bacterias orales beneficiosas como bacterias orales perjudiciales) y es sensible a la dosis y al tiempo.

La infección bacteriana del tejido oral estimula la respuesta inmune del hospedador y disminuye el proceso de curación regulando positivamente los mediadores inflamatorios que causan un daño tisular significativo. Estos metabolitos se han implicado como los mediadores principales en gingivitis, periodontitis, osteomielitis y otras enfermedades inflamatorias.

Se ha informado de que un mecanismo de inflamación está mediado a través de ciertos receptores transmembrana de las células de mamífero. Por ejemplo, los receptores tipo toll ("TLR") , son proteínas transmembrana glucosiladas y una vez activadas por la oligomerización inducida por ligando inician una respuesta inmune dentro de la célula, provocando finalmente la expresión de citoquinas, interleuquinas, y otras moléculas que median el estado de la inflamación.

Existe la necesidad en la técnica de agentes y técnicas útiles en el diagnóstico, tratamiento, y prevención de dichos efectos inflamatorios.

El documento WO-A-95/13094 desvela el tratamiento de enfermedades inflamatorias inducidas de forma bacteriana. El documento WO-A-01/55386 desvela un receptor tipo toll. El documento WO-A-2005/057222 desvela el uso de Tcadherina como diana.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra la superficie de una célula en contacto con un microbio.

La Figura 2 muestra las vías de señalización de los receptores tipo toll (TLR) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9, así como las diversas moléculas generadas por la modulación de cada TLR.

Breve sumario de la invención La invención incluye un método de acuerdo con la reivindicación 1 para determinar el efecto anti-inflamatorio de un agente, que comprende poner en contacto la célula con el agente en presencia de una bacteria perjudicial o parte de dicha bacteria y detectar la presencia de un compuesto indicador, donde la ausencia sustancial de un material indicador significa que el agente es un agente anti-inflamatorio.

Las características preferidas se definen en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de la invención La invención proporciona métodos para determinar el efecto anti-inflamatorio de un agente específico. También se describen en el presente documento métodos para prevenir la modulación de un receptor tipo toll en una célula usando triclosán.

"Inflamación" como se usa en el presente documento se refiere a la respuesta protectora localizada provocada por

lesión o destrucción de tejidos que sirve para destruir, diluir, o secuestrar tanto al agente dañino como al tejido lesionado. En la forma aguda, puede caracterizarse por dolor, calor, rojez, e hinchamiento. Histológicamente, la inflamación implica una compleja serie de acontecimientos, incluyendo la dilatación de arteriolas, capilares, y vénulas, con permeabilidad y flujo sanguíneo aumentados; exudación de fluidos, incluyendo proteínas plasmáticas, y migración de leucocitos en el locus inflamatorio. La inflamación corresponde a niveles potenciados de mediadores celulares pro-inflamatorios, o sustancias que se liberan, por ejemplo, como resultado de la interacción de un antígeno con un anticuerpo o por la acción del antígeno con un linfocito sensibilizado. Por extensión, un agente antiinflamatorio es cualquiera que reduzca la calidad y/o cantidad de estos efectos biológico en una célula, con relación a una célula similar no tratada con el agente.

En el presente documento se describe un método para evaluar una especie específica o cepa de bacterias para determinar si dicha especie o cepa es perjudicial en la cavidad oral. Por "perjudicial" se entiende bacterias patogénicas cuya presencia provoca la generación de mediadores inflamatorios por parte de las células afectadas. Se ha informado de que algunas cepas/especies de bacterias son perjudiciales, incluyendo aquellas de la Tabla I, a continuación:

Tabla 1: Bacterias orales presentadas como perjudiciales

A. gerencseriae

A. naeslundii 1

A. naeslundii 2

V. parvula

S. mitis

S. oralis

C. gingivalis

C. sputigena

F. nucleatum ss nucleatum

F. nucleatum ss polymorphum

F. periodonticum

P. intermedia

T. forsytia

L. buccalis

N. mucosa

P. acnes

P. melaninogenica

S. noxia

El método incluye poner en contacto al menos una bacteria de la especie o cepa de bacteria oral a evaluar con al menos una célula gingival. Como alternativa, la célula gingival puede ponerse en contacto con una parte de la bacteria, la membrana celular, los contenidos citoplasmáticos, los productos metabólicos, finales o subproductos de la bacteria y/o factores de virulencia.

Esta etapa puede suceder in vitro, por ejemplo, manteniendo un cultivo de bacterias o partes bacterianas y de células gingivales y combinando dichos cultivos. Como alternativa, el contacto puede suceder in vivo, por aplicación del cultivo bacteriano en un vehículo de suministro apropiado a la cavidad oral.

Después de dicho contacto, puede detectarse uno o más materiales indicadores. Dichos materiales indicadores incluyen cualquiera que sea conocido o esté por descubrirse que se generan en el transcurso ordinario de la respuesta inmune de un hospedador incluyendo compuestos intermedios, enzimas, proteínas, ARN, ADN, y otras moléculas que están implicadas en la producción celular de citoquinas y otros mediadores pro-inflamatorios. Se prefieren materiales indicadores que se generan por la modulación de cualquiera de los receptores tipo toll (por

ejemplo, como se muestra en la Figura 2) , incluyendo, por ejemplo, TLR 2, 3, 4, 5, 7, y 9; moléculas de la vía NFk-B, citoquinas, interleuquinas (por ejemplo, 1, 6, 8, 12) , factor de necrosis tumoral (TNF) , peptidasas, y ARNm que codifican las subunidades de interleuquinas o TNF y/o interleuquinas, quimioquinas (por ejemplo, CCL5, CCL4, CCL3, y CC10) , y metaloproteinasas de matriz.

La detección del material indicador seleccionado puede realizarse de cualquier modo conocido o por desarrollar en la técnica y puede ser una medición relativa o absoluta. La detección puede conseguirse por medición directa de la cantidad de material o materiales indicadores seleccionados. Como alternativa, puede conseguirse por medición indirecta usando sistemas de detección adicionales, tales como marcadores radiactivos y/o fluorescentes, anticuerpos, alteraciones en el nivel de expresión génica de genes específicos, análisis de ARNm, análisis de microserie, y/o cambios en el estado antioxidante. Por ejemplo, si el material indicador es una enzima, se puede someter a la muestra a un sustrato apropiado y medir el producto final de una reacción catalizada por enzima para determinar la presencia o ausencia del material indicador enzimático. En la práctica de este aspecto de la invención, la ausencia sustancial del material indicador seleccionado demuestra que la especie/cepa de bacteria no es perjudicial -es decir, no afecta a la célula de tal modo que inicie la producción de ningún mediador pro-inflamatorio.

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1. Un método para determinar el efecto anti-inflamatorio de un agente que comprende poner en contacto la célula con el agente en presencia de una bacteria perjudicial o parte de dicha bacteria y detectar la presencia de un compuesto indicador, donde la ausencia sustancial de un material indicador significa que el agente es un agente anti-inflamatorio.

2. El método de la reivindicación 1, donde la célula es una célula eucariota.

3. El método de la reivindicación 1, donde la célula es una célula procariota.

4. El método de la reivindicación 1, donde el material indicador se selecciona entre el grupo que consiste en moléculas generadas por la modulación de un receptor tipo toll.

5. El método de la reivindicación 1, donde el material indicador se selecciona entre el grupo que consiste en moléculas generadas por la modulación de TLR 2, TLR 3, TLR 4, TLR 5, TLR 7, y TLR 9.

6. El método de la reivindicación 1, donde el material indicador se selecciona entre el grupo que consiste en moléculas de la vía NF-κB. 20

7. El método de la reivindicación 1, donde el material indicador se selecciona entre el grupo que consiste en citoquinas e interleuquinas.

8. El método de la reivindicación 1, donde el material indicador se selecciona entre el grupo que consiste en IL-1, IL25 6, IL-8, IL-12, y TNF-!.

9. El método de la reivindicación 1, donde la molécula indicadora se detecta directamente.

10. El método de la reivindicación 1, donde el se selecciona entre agentes que muestran una CIM de menos de 30 aproximadamente el 20%.