Métodos para la determinación de la actividad de escisión del factor de von Willebrand de la proteasa ADAMTS-13.

Método para determinar la actividad de escisión del factor de von Willebrand (VWF) de la proteasa ADAMTS-13en una muestra,

el cual comprende los siguientes pasos:

a) mezclar la muestra que contiene presumiblemente la proteasa ADAMTS-13 con VWF aislado comosustrato para producir una mezcla de reacción,

b) Incubación de la mezcla de reacción, y

c) Determinación de la actividad restante de VWF en la mezcla de reacción, en cuyo caso

el sustrato de VWF se compone de VWF multimérico, de alto peso molecular, el cual contiene monómeros de VWFque tienen al menos una variación de secuencia de aminoácido, que lleva a que el sustrato de VWF - comparadocon un sustrato de VWF que se compone de VWF multimérico de alto peso molecular de monómeros de VWF detipo silvestre conduzca a una degradación acelerada por parte de ADAMTS-13,

caracterizado porque

en el paso c) la determinación de la actividad restante de VWF en la mezcla de reacción se efectúa con un métodoen el cual la muestra se mezcla con proteína GPlbα aislada que comprende una secuencia de aminoácido, quecontiene, en comparación con la secuencia de tipo silvestre de la proteína GPlbα humana (SEQ ID NO:1), al menoslos residuos de aminoácidos 1-268, y tiene respectivamente una sustitución de aminoácido Xaa en las posiciones233 y 239, para producir una mezcla de ensayo, y en el cual a la mezcla de reacción no se agrega ristocetina y nibotrocetina.

Métodos para la determinación de la actividad de escisión del factor de von Willebrand de la proteasa ADAMTS-13

La invención se encuentra en el campo de la diagnosis de coagulación y se refiere a un método para determinar la actividad de escisión del factor de von Willebrand (VWF) de la proteasa ADAMTS-13.

ADAMTS-13 (“a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs”, o una desintegrina y metaloproteasa con motivos de trombospondina) es una metaloproteasa que escinde el factor de von Willebrand (VWF) de modo proteolítico y de esta manera reduce su actividad. Se conocen deficiencias congénitas y heredadas de la actividad enzimática de ADAMTS-13, las cuales causan diversas enfermedades como, por ejemplo, púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) , una patología tromboembólica peligrosa para la vida que afecta a la microcirculación. En el plasma de pacientes con PTT se encuentran multímeros del VWF extraordinariamente grandes, y se consideran una causa para la formación de trombos ricos en VWF y trombocitos. La determinación de la actividad de proteasa que escinde VWF de la proteasa ADAMTS-13 en muestras de pacientes es, por lo tanto, de importancia diagnóstica.

En el estado de la técnica se conocen diferentes métodos para determinar la actividad de escisión de VWF de la proteasa ADAMTS-13 o para diagnóstico de una deficiencia de ADAMTS-13:

Furlan et al. (1996) describen un método en el que la muestra que contiene la proteasa ADAMTS-13 se incuba con VWF humano purificado en calidad de sustrato, y en cuyo caso la detección de la actividad proteolítica de la proteasa de ADAMTS-13 se efectúa mediante un análisis multimérico de VWF posterior, mediante una electroforesis en gel de agarosa- SDS, o mediante un análisis de un fragmento de VWF mediante electroforesis en gel de poliacrilamida - SDS (SDS-PAGE) e inmunoblotting posterior [Furlan, M., Robles, R. and Lämmle, B. (1996) Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis (Purificación y caracterización parciales de una proteasa del plasma humano que escinde el factor de von Willebrand en fragmentos producidos por proteólisis in vivo) . Blood 87, 10: 4223-4234]. Análisis multiméricos de este tipo mediante electroforesis en gel son extremadamente costosos en trabajo y tiempo, y por lo tanto no son adecuados para su empleo en un laboratorio clínico.

Otros métodos de ensayo funcionales determinan la actividad proteolítica de la proteasa ADAMTS-13, incubando la muestra que contiene la proteasa ADAMTS-13 con VWF como sustrato, y a continuación se determina la pérdida de actividad del sustrato VWF. Cuanto más proteasa de ADAMTS-13 está contenida en la muestra, más sustrato VWF se escinde y menor actividad de VWF puede detectarse después en la mezcla de reacción. La ventaja de estos métodos funcionales consiste en que utilizando el VWF como sustrato y midiendo la pérdida de función de los multímeros grandes se simula la función relevante in vivo de la proteasa ADAMTS-13 in vitro.

La patente WO 2004/005451 A2 revela un método en el que una muestra que contiene la proteasa de ADAMTS-13 se incuba con VWF humano purificado como sustrato, y en cuyo caso la detección de la actividad proteolítica de la proteasa ADAMTS-13 se efectúa mediante una determinación posterior de la actividad de VWF que queda en la mezcla de reacción, mediante un ensayo de cofactor de ristocetina. De modo alternativo, la actividad de VWF que queda en la mezcla de reacción se efectúa por medio de un ensayo de enlace de colágeno (véase por ejemplo WO 00/50904) . La desventaja es que la mezcla de reacción tiene que incubarse durante mucho tiempo, en parte durante una noche con el fin de producir una degradación proteolítica suficiente del VWF. Un método mejorado en el que el tiempo de incubación se reduce a 60 minutos está descrito en Kostousov, V., Fehr, J., Bombeli, T. (2006) Novel, semiautomated, 60-min-assay to determine von Willebrand factor cleaving activity of ADAMTS-13 (Ensayos de 60 minutos semiautomáticos novedosos para determinar actividad de escisión de factor de von Willebrand de ADAMTS13) . Thrombosis Res. 118: 723-731.

Las patentes estadounidenses US 2007/0065895 A1 y US 2005/0186646 A1 revelan métodos en los que una muestra que contiene la proteasa ADAMTS-13 se incuba con péptidos que tienen un sitio de corte o escisión específico para la proteasa ADAMTS-13, o se incuban péptidos VWF (partes) en calidad de sustrato, y en cuyo caso la detección de la actividad proteolítica de la proteasa ADAMTS-13 se efectúa mediante un análisis posterior de los fragmentos de péptido resultantes por medio de SDS-PAGE y de manera opcional mediante inmunoblotting posterior.

Las desventajas de los sistemas de ensayo consisten en que, o bien son muy complicados desde el punto de vista técnico como, por ejemplo, el análisis de los fragmentos de sustrato resultantes de la proteólisis mediante SDS-PAGE, o bien en que no utilizan el sustrato natural de VWF, por lo cual algunas disfuncionalidades de la proteasa ADAMTS-13 pueden posiblemente no reconocerse.

El objeto fundamental de la presente invención era proporcionar un método para determinar la actividad de escisión del factor de von Willebrand de la proteasa ADAMTS-13 que haga posible detectar tantas disfuncionalidades de la

proteasa ADAMTS-13 como sean posibles con el método, y el cual pueda realizarse con ahorro de tiempo y de modo automático en aparatos de análisis clínicos convencionales.

El objeto se resuelve mezclando una muestra que presumiblemente contiene la proteasa ADAMTS-13, con VWF aislado como sustrato para producir una mezcla de reacción, en cuyo caso el sustrato de VWF se compone de VWF multimérico de alto peso molecular que contiene monómeros VWF que tienen al menos una variación de secuencia de aminoácido (polimorfismo o mutación) , lo que respectivamente lleva a que el sustrato de VWF, comparado con un sustrato de VWF que se compone de VWF multimérico, de alto peso molecular de monómeros VWF de tipo silvestre, conduzca a una degradación acelerada por ADAMTS-13.

El monómero VWF humano se sintetiza primero in vivo como proteína precursora de 2813 aminoácidos de longitud. Mediante procesamiento intracelular se generan multímeros VWF que pueden volverse de más de 20 000 kDa de tamaño. Estos multímeros se componen de monómeros VWF de 2050 aminoácidos de longitud, enlazados entre sí por puentes de disulfuro, dispuestos linealmente. En el plasma circula el VWF en forma globular de multímeros con diferente tamaño, de aproximadamente 500 kDa (dímero) a más de 15 000 kDa de tamaño.

Por un "sustrato VWF multimérico de alto peso molecular" debe entenderse, en relación con la presente invención, una proteína VWF que se compone de más de 10 moléculas VWF dimerizadas y que es mayor a 5000 kDa, lo cual puede establecerse mediante métodos de electroforesis en gel conocidos por el especialista. Además, el VWF multimérico de alto peso molecular contiene monómeros VWF, que tienen al menos una variación de secuencia de aminoácido la cual lleva respectivamente a que el sustrato de VWF – en comparación con un sustrato de VWF que se compone de VWF multimérico de alto peso molecular de monómeros de VWF de tipo silvestre – conduzca a una degradación acelerada mediante ADAMTS-13.

Las variaciones de secuencia de aminoácido de la proteína de VWF, las cuales elevan la susceptibilidad del VWF por un corte proteolítico mediante la proteasa ADAMTS-13, pertenecen al estado de la técnica [véase, por ejemplo, Hassenpflug, W.A., Budde, U., Obser, T., Angerhaus, D., Drewke, E., Schneppenheim, S., Schneppenheim, R. (2006) Impact of mutations in the von Willebrand factor A2 domain on ADAMTS13-dependent proteolysis (Impacto de mutaciones en el dominio de factor de von Willebrand A2 en la proteólisis dependiente de ADAMTS13) . Blood

107: 2339-2345 o Rayes, J., Hommais, A., Legendre, P., Tout, H., Veyradier, A., Obert, B., Ribba, A.S., Girma, J.P. (2006) Effect of von Willebrand disease type 2B and type 2M mutations on the susceptibility of von Willebrand factor to ADAMTS-13 (Efecto de enfermedad de von Willebrand tipo 2B y mutaciones tipo 2M sobre la susceptibilidad de von Willebrand factor a ADAMTS-13) . J Thromb Haemost. 5: 321-328]. Para la presente invención es principalmente adecuado un sustrato VWF que se compone de VWF multimérico de alto peso molecular, el cual contiene monómeros VWF que tienen al menos una variación de secuencia de aminoácido del siguiente grupo:

P1648S, E1638K, G1505R, S1506L, M1528V, R1569del, R1597W, V1607D, G1609R, G1629E, G1631D, R1597Q, V1499E y Y1584C.

1. Método para determinar la actividad de escisión del factor de von Willebrand (VWF) de la proteasa ADAMTS-13 en una muestra, el cual comprende los siguientes pasos:

a) mezclar la muestra que contiene presumiblemente la proteasa ADAMTS-13 con VWF aislado como sustrato para producir una mezcla de reacción,

b) Incubación de la mezcla de reacción, y

c) Determinación de la actividad restante de VWF en la mezcla de reacción, en cuyo caso el sustrato de VWF se compone de VWF multimérico, de alto peso molecular, el cual contiene monómeros de VWF que tienen al menos una variación de secuencia de aminoácido, que lleva a que el sustrato de VWF – comparado con un sustrato de VWF que se compone de VWF multimérico de alto peso molecular de monómeros de VWF de tipo silvestre conduzca a una degradación acelerada por parte de ADAMTS-13,

caracterizado porque en el paso c) la determinación de la actividad restante de VWF en la mezcla de reacción se efectúa con un método en el cual la muestra se mezcla con proteína GPlba aislada que comprende una secuencia de aminoácido, que contiene, en comparación con la secuencia de tipo silvestre de la proteína GPlba humana (SEQ ID NO:1) , al menos los residuos de aminoácidos 1-268, y tiene respectivamente una sustitución de aminoácido Xaa en las posiciones 233 y 239, para producir una mezcla de ensayo, y en el cual a la mezcla de reacción no se agrega ristocetina y ni botrocetina.

2. Método según la reivindicación 1, donde los monómeros de VWF del sustrato de VWF de VFW multimérico, de alto peso molecular tienen al menos una variación de secuencia de aminoácido de los siguientes grupos:

P1648S, E1638K, G1505R, S1506L, M1528V, R1569del, R1597W, V1607D, G1609R, G1629E, G1631D, R1597Q, V1499E y Y1584C.

3. Método según una de las reivindicaciones 1 o 2, donde el sustrato de VWF multimérico de alto peso molecular se produce de modo recombinante.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 o 2, donde el sustrato de VWF multimérico, de alto peso molecular se aísla de plasmas de donantes de soportes heterocigóticos u homocigóticos de una adecuada variación de secuencia de aminoácidos de VWF.

5. Método según una de las reivindicaciones precedentes, donde en el paso a) la muestra se mezcla adicionalmente con heparina.

6. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sustitución de aminoácido Xaa en posición 233 y/o posición 239 de la proteína GPlba utilizada se compone de un residuo de valina o de un residuo de serina.

7. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la proteína GPlba utilizada está asociada con una fase sólida, de manera preferente con una fase sólida en forma de partículas.

8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque la actividad de VWF se determina mediante la aglutinación mediada por GPlba de la fase sólida en forma de partículas.