Métodos de selección de animales resistentes a huéspedes.

Método de selección de ungulados que son genéticamente resistentes a infecciones por uno o másgusanos nematodos,

comprendiendo dicho método las etapas:

(a) obtener una muestra de mucosa de dicho ungulado;

(b) someter a prueba la muestra para detectar la presencia de un anticuerpo contra el antígeno de cubiertaprotectora de hidratos de carbono (CarLA) presente en la tercera fase larvaria (L3) de dicho uno o másgusanos nematodos; y

(c) separar y seleccionar ungulados que tienen un resultado positivo para el anticuerpo en la etapa (b), en elque la muestra de mucosa comprende fluido mucoso de la nariz, boca, garganta, cavidad rectal o vagina.

Métodos de selección de animales resistentes a huéspedes

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de selección de animales que son resistentes a parásitos, y a una prueba de diagnóstico para detectar la resistencia a parásitos en animales. En particular, la prueba de diagnóstico se basa en la detección de anticuerpos frente a antígenos de parásitos en fluido mucoso del animal. Específicamente, aunque en absoluto de manera exclusiva, la invención se refiere a la selección de ovejas y bovinos que son resistentes a infección por gusano nematodo.

Ninguna afirmación en esta memoria descriptiva debería interpretarse como que se refiere a un procedimiento biológico esencial, en particular a un procedimiento que implicara una etapa de cruzar y seleccionar animales.

Antecedentes de la invención Los parásitos internos, y especialmente la infección por gusano nematodo, es uno de los mayores problemas de salud en granjas de ovejas y bovinos en todo el mundo. Tales parásitos internos provocan costosas reducciones en la producción del animal y, si no se tratan, la muerte del animal.

Tradicionalmente, las infecciones por parásito se tratan con agentes antihelmínticos. Hay tres familias de productos químicos a partir de los cuales se formulan todos los agentes antihelmínticos, que incluyen (1) los bencimidazoles;

(2) levamisol y morantel; y (3) ivermectina. La eficacia de estos compuestos se ha reducido ya que se desarrolla resistencia en los parásitos. De hecho, recientes encuestas financiadas por la industria en Nueva Zelanda han encontrado que el 64% de las granjas de ovejas y el 94% de las granjas de terneros tienen ahora parásitos que son resistentes a al menos una de las tres clases de antihelmínticos. Se estima que tal resistencia cuesta a la industria de ovejas en Nueva Zelanda más de veinte millones de dólares al año en pérdidas de productividad (principalmente mediante resistencia no detectada) y aumento de los gastos (forzándose a los granjeros a usar productos de gran dosis caros) .

No ha habido nuevas clases de antihelmínticos desde hace algún tiempo, y no es probable que se haga disponible una nueva clase en el futuro inmediato que sea rentable para el tratamiento de infecciones por nematodo a menos que se haya producido resistencia a las tres familias de antihelmínticos.

Se han propuesto métodos alternativos de control del efecto de infecciones por parásito en la granja, e incluyen tratamiento de pasto alterado, uso de hongos que atrapan nematodos, complementos dietéticos, vacunas y la cría selectiva de animales para obtener resistencia a huéspedes.

La selección de ovejas y bovinos que son resistentes de manera natural a nematodos intestinales ha sido satisfactoria en varias especies en Nueva Zelanda, Australia e Irlanda. Tal selección se logra actualmente usando un recuento de huevos en heces (FEC) . Este método es costoso y requiere mucho trabajo, y requiere exponer los animales a una exposición a parásitos razonable durante aproximadamente de seis a ocho semanas tras el destete. Se usa el promedio de dos recuentos de huevos tomados a lo largo de este periodo de seis a ocho semanas para evaluar la resistencia a parásitos de cada animal. También se ha estimado que se requieren al menos ocho años de selección antes de obtener FEC sistemáticamente bajos.

Otros métodos para seleccionar animales que son resistentes a huéspedes incluyen métodos de selección de animales que muestran altos niveles de inmunidad natural frente a los parásitos. Algunos estudios con ovejas han mostrado que esta inmunidad está correlacionada con FEC reducido y puede realizarse mediante anticuerpos (IgG1, IgE, IgA) , eosinófilos, mastocitos, células calciformes, secreción de fluidos y electrolitos, aumento de la actividad del músculo liso y aumento de la renovación de células epiteliales. Sin embargo, no se ha mostrado que todas estas respuestas inmunitarias sean eficaces en la prevención del establecimiento de larvas o la expulsión de nematodos adultos.

El documento WO 03/064475 da a conocer un posible marcador de resistencia inmunitaria que puede usarse para seleccionar animales con niveles aumentados de resistencia genética. En particular, se mostró que las ovejas resistentes de manera natural producían anticuerpos frente a un antígeno presente en las larvas en tercera fase de nematodos parásitos. Este antígeno consiste en una cubierta protectora de hidratos de carbono (CarLA) . Se han detectado anticuerpos frente a CarLA en la mucosa intestinal. Se ha mostrado que el nivel de anticuerpos en la mucosa intestinal está correlacionado con un FEC reducido y previene el establecimiento de larvas (Harrison et al, 2003) . Sin embargo, obviamente la toma de muestras de mucosa en animales de prueba para detectar la resistencia a huéspedes no es práctica.

El documento WO 03/064475 da a conocer una prueba de diagnóstico que mide la presencia de un anticuerpo frente a CarLA o del antígeno CarLA en sí mismo en una muestra de sangre. Sin embargo, en esta memoria descriptiva no se mostró como ejemplo una prueba de este tipo, de modo que no queda claro si los anticuerpos frente a CarLA o el antígeno CarLA pueden detectarse en la sangre, o aunque puedan detectarse, si tales niveles de anticuerpo o antígeno en la sangre se correlacionan o no con la resistencia a huéspedes.

Además, aunque el análisis de sangre descrito en el documento WO 03/064475 fuera útil para seleccionar animales resistentes, un análisis de sangre de este tipo requeriría mucho trabajo y sería costoso ya que se requeriría someter a prueba las muestras en laboratorios profesionales. Además, los granjeros serían reacios a usar una prueba invasiva de este tipo.

Sería deseable una prueba más sencilla que requiriera una recogida de muestras fácil, de modo que requiriera menos trabajo, y fuera menos cara, proporcionara resultados más rápido y fuera práctica para su uso en la granja.

Un objeto de la presente invención es avanzar hacia la obtención de este deseo y/o proporcionar al público una opción útil.

Explicación de la invención En su sentido más amplio, la invención se refiere al objeto definido en las reivindicaciones adjuntas.

1. Método de selección de ungulados que son genéticamente resistentes a infecciones por uno o más gusanos nematodos, comprendiendo dicho método las etapas:

(a) obtener una muestra de mucosa de dicho ungulado;

(b) someter a prueba la muestra para detectar la presencia de un anticuerpo contra el antígeno de cubierta protectora de hidratos de carbono (CarLA) presente en la tercera fase larvaria (L3) de dicho uno o más gusanos nematodos; y

(c) separar y seleccionar ungulados que tienen un resultado positivo para el anticuerpo en la etapa (b) en el que la muestra de mucosa comprende fluido mucoso de la nariz, boca, garganta, cavidad rectal o vagina.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra de mucosa comprende saliva.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el uno o más gusanos nematodos se seleccionan del grupo que consiste en Trichostrongylus colubriformis, Haemonchus contortus, Ostertagia (Teladorsagia) circumcincta, Cooperia curticei, Nematodirus spathiger, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus vitrinus, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophera, Nematodirus brasiliensis y Dictyocaulus eckerti.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo comprende anticuerpo monoclonal AcM PAB-1 (n.º de registro de ATCC PTA-4005) , que se une específicamente al antígeno de superficie CarLA en L3 de nematodo.

5. Método para detectar la presencia de anticuerpos que son específicos para un antígeno de superficie CarLA de L3 presente en una o más especies de gusanos nematodos en una muestra de mucosa de un ungulado, comprendiendo dicho método las etapas:

(a) obtener una muestra de mucosa de dicho ungulado que comprende fluido mucoso de la nariz, boca, garganta, cavidad rectal o vagina;

(b) poner en contacto dicha muestra con el antígeno de superficie CarLA de L3, formando así un complejo anticuerpo/antígeno; y

(c) detectar la presencia o ausencia del complejo;

en el que la presencia de dicho complejo anticuerpo/antígeno es indicativa de un ungulado que es genéticamente resistente a infección por gusano nematodo.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la muestra de mucosa es saliva.

7. Método según la reivindicación 5 ó 6, en el que el antígeno se selecciona de uno o más antígenos CarLA de L3 de nematodo seleccionados del grupo que consiste en:

(a) un antígeno de superficie en... [Seguir leyendo]

1. Método de selección de ungulados que son genéticamente resistentes a infecciones por uno o más gusanos nematodos, comprendiendo dicho método las etapas:

(a) obtener una muestra de mucosa de dicho ungulado;

(b) someter a prueba la muestra para detectar la presencia de un anticuerpo contra el antígeno de cubierta protectora de hidratos de carbono (CarLA) presente en la tercera fase larvaria (L3) de dicho uno o más gusanos nematodos; y

(c) separar y seleccionar ungulados que tienen un resultado positivo para el anticuerpo en la etapa (b) , en el que la muestra de mucosa comprende fluido mucoso de la nariz, boca, garganta, cavidad rectal o vagina.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra de mucosa comprende saliva.

3. Método según la reivindicación 1, en el que el uno o más gusanos nematodos se seleccionan del grupo que consiste en Trichostrongylus colubriformis, Haemonchus contortus, Ostertagia (Teladorsagia) circumcincta, Cooperia curticei, Nematodirus spathiger, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus vitrinus, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophera, Nematodirus brasiliensis y Dictyocaulus eckerti.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo comprende anticuerpo monoclonal AcM PAB-1 (n.º de registro de ATCC PTA-4005) , que se une específicamente al antígeno de superficie CarLA en L3 de nematodo.

5. Método para detectar la presencia de anticuerpos que son específicos para un antígeno de superficie CarLA de L3 presente en una o más especies de gusanos nematodos en una muestra de mucosa de un ungulado, comprendiendo dicho método las etapas:

(a) obtener una muestra de mucosa de dicho ungulado que comprende fluido mucoso de la nariz, boca, garganta, cavidad rectal o vagina;

(b) poner en contacto dicha muestra con el antígeno de superficie CarLA de L3, formando así un complejo anticuerpo/antígeno; y

(c) detectar la presencia o ausencia del complejo;

en el que la presencia de dicho complejo anticuerpo/antígeno es indicativa de un ungulado que es genéticamente resistente a infección por gusano nematodo.

6. Método según la reivindicación 5, en el que la muestra de mucosa es saliva.

7. Método según la reivindicación 5 ó 6, en el que el antígeno se selecciona de uno o más antígenos CarLA de L3 de nematodo seleccionados del grupo que consiste en;

(a) un antígeno de superficie en C. curticei que corre a sustancialmente 46 kDa y a sustancialmente 22 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(b) un antígeno de superficie en N. spathiger que corre a sustancialmente 22 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(c) un antígeno de superficie en H. contortus que corre a sustancialmente 35 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras; y

(d) un antígeno de superficie en O. circumcincta que corre a sustancialment.

3. 39 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(e) un antígeno de superficie en T. axei o T. vitrinus que corre a sustancialmente 35 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(f) un antígeno de superficie en O. ostertagi que corre a sustancialment.

3. 45 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(g) un antígeno de superficie en C. oncophera que corre a sustancialmente 20 kDa y a sustancialmente 45 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(h) un antígeno de superficie en N. brasiliensis que corre a sustancialmente 9 kDa y a sustancialmente 12 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras; y

(i) un antígeno de superficie en D. eckerti que corre a sustancialmente 30 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el antígeno está inmovilizado sobre una superficie sólida y el complejo se detecta usando un marcador en el antígeno que es detectable cuando se forma el complejo.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el complejo se detecta usando un segundo anticuerpo marcado que se une al complejo.

10. Método según la reivindicación 8 ó 9, en el que la detección se lleva a cabo usando una tira reactiva que comprende uno o más antígenos inmovilizados.

11. Kit para detectar la presencia de un anticuerpo específico para uno o más antígenos de superficie CarLA de L3 de nematodo, comprendiendo dicho kit:

(a) un recipiente para una muestra de mucosa;

(b) un reactivo que comprende uno o más antígenos CarLA de L3 de nematodo marcados; y

(c) unos medios de recogida de muestras de mucosa;

en el que la muestra de mucosa se selecciona de una muestra de la nariz, boca, garganta, cavidad rectal o vagina.

12. Kit según la reivindicación 11, que comprende

(d) una tira reactiva que comprende uno o más antígenos CarLA de L3 de nematodo inmovilizados; y

(e) un reactivo que comprende un segundo anticuerpo marcado.

13. Kit según la reivindicación 11 ó 12, en el que el recipiente de muestra es para saliva.

14. Kit según la reivindicación 11 ó 12, en el que los medios de recogida son para recoger saliva.

15. Kit según la reivindicación 11, que comprende además instrucciones de uso.

16. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, que comprende además medios de detección para detectar uno o más antígenos marcados.

17. Kit según la reivindicación 12, que comprende además medios de detección para detectar un segundo anticuerpo marcado.

18. Método de diagnóstico de infección por nematodo en un animal ungulado que comprende las etapas:

(a) obtener una muestra de mucosa del ungulado; y

(b) analizar la muestra para detectar la presencia de un anticuerpo contra uno o más antígenos CarLA de L3 de nematodo;

en el que la muestra de mucosa se selecciona de una muestra de la nariz, boca, garganta, cavidad rectal o vagina.

19. Método de determinación de resistencia a nematodos en un ungulado sometiendo a ensayo una muestra de mucosa del ungulado para detectar la presencia de un anticuerpo específico para uno o más antígenos CarLA de L3 de muestra, poniendo en contacto la muestra con uno o más antígenos seleccionados del grupo que consiste en:

(a) un antígeno de superficie en C. curticei que corre a sustancialmente 46 kDa y a sustancialmente 22 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(b) un antígeno de superficie en N. spathiger que corre a sustancialmente 22 kDa en gel de SDS-PAGE en

condiciones reductoras;

(c) un antígeno de superficie en H. contortus que corre a sustancialmente 35 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras; y

(d) un antígeno de superficie en O. circumcincta que corre a sustancialment.

3. 39 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(e) un antígeno de superficie en T. axei o T. vitrinus que corre a sustancialmente 35 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(f) un antígeno de superficie en O. ostertagi que corre a sustancialment.

3. 45 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(g) un antígeno de superficie en C. oncophera que corre a sustancialmente 20 kDa y a sustancialmente 45 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras;

(h) un antígeno de superficie en N. brasiliensis que corre a sustancialmente 9 kDa y a sustancialmente 12 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras; y

(i) un antígeno de superficie en D. eckerti que corre a sustancialmente 30 kDa en gel de SDS-PAGE en condiciones reductoras,

y medir la presencia o ausencia de complejo anticuerpo/antígeno en la muestra, mediante lo cual la presencia del complejo es indicativa de resistencia a nematodos en el ungulado, y en el que la muestra de mucosa se selecciona de una muestra de la nariz, boca, garganta, cavidad rectal o vagina.

20. Método de diagnóstico de infección por nematodo según la reivindicación 18 o método de determinación de la resistencia a nematodos según la reivindicación 19, en el que la muestra de mucosa es saliva.