Método y sistema para la congelación a velocidad controlada de material biológico.

Un congelador o sistema de congelación criogénico para materiales biológicos que comprende:

una fuente de criógeno (230, 240);

un circuito de entrada (12; 262) acoplado a la fuente de criógeno y adaptado para proporcionar un flujo uniforme deun gas frio criogénico 5 a una cámara de enfriamiento (52; 220);

la cámara (52; 220) de enfriamiento que comprende una cámara (32; 266) de entrada, un colector (34; 225) desalida, y dos o más superficies (16, 19) porosas paralelas que definen un área (30) de enfriamiento entre superficiesparalelas adyacentes con una de las superficies porosas paralelas dispuesta adyacente a la cámara de entrada y encomunicación fluida con la cámara de entrada y otra de las superficies porosas paralelas dispuesta adyacente alcolector de salida, las superficies porosas paralelas y el área de enfriamiento adaptadas para retener una pluralidadde recipientes (20) de materiales biológicos;

un circuito (28) de salida adaptado para retirar el gas criogénico del colector (34) de salida de la cámara deenfriamiento; y

un sistema (70, 270) de control adaptado para ajustar los caudales de la fuente de criógeno en el circuito de entraday de cualquier gas criogénico en el circuito de salida para ajustar la temperatura del gas criogénico frio suministradoa la cámara de enfriamiento en respuesta a una velocidad de enfriamiento deseada de los materiales biológicos y alas temperaturas medidas dentro de la cámara de enfriamiento;

en el que un flujo laminar, unidireccional y uniforme de gas frio criogénico a temperatura ajustada se suministra a unárea de enfriamiento entre las superficies porosas paralelas y cada uno de la pluralidad de recipientes para enfriaruniformemente los materiales biológicos.

Método y sistema para la congelación a velocidad controlada de material biológico Campo de la invención La presente invención se refiere en términos generales a un procedimiento de crioconservación y más particularmente a un método y sistema para proporcionar la congelación a velocidad controlada de materiales biológicos que minimiza el daño celular que es el resultado de la formación de hielo intercelular y de los efectos del soluto que surgen durante el procedimiento de crioconservación.

Antecedentes de la invención La crioconservación es un procedimiento usado para estabilizar materiales biológicos a muy bajas temperaturas. Los intentos previos para congelar materiales biológicos, tales como células vivas a menudo dan como resultado una pérdida significativa de viabilidad celular y en algunos casos tanto como 80% o más pérdida de actividad y viabilidad celular.

En algunos casos, el daño celular durante la crioconservación usualmente ocurre como resultado de la formación de hielo intracelular dentro de la célula viva durante la etapa de congelación o durante la recristalización. El enfriamiento rápido conduce a menudo a la formación de más hielo intracelular dado que las moléculas de agua no migran totalmente fuera de la célula durante el corto periodo de tiempo asociado a las rápidas velocidades de enfriamiento. La formación de hielo intercelular puede surgir también durante la recristalización que ocurre durante los ciclos de calentamiento o deshielo. Si queda demasiado agua dentro de la célula viva, puede ocurrir daño debido a la formación inicial de cristales de hielo durante la rápida fase de enfriamiento y la subsecuente recristalización durante las fases de calentamiento y tal daño es usualmente letal.

Por otra parte, los perfiles de enfriamiento lento durante la crioconservación a menudo dan como resultado un incremento en los efectos del soluto cuando migra exceso de agua fuera de las células. El exceso de agua que migra de las células afecta adversamente a las células debido a un incremento del desequilibrio osmótico. De este modo, ocurre un daño celular como resultado de los desequilibrios osmóticos que pueden ser perjudiciales para la supervivencia celular y finalmente conduce al daño celular y viabilidad celular.

Del documento WO-A-01/95716 se conoce un método de congelación o enfriamiento a velocidad controlada de materiales biológicos, en tal método el material se sumerge en un depósito de fluido de enfriamiento, y el fluido de enfriamiento se hace circular pasando por el material a una velocidad y temperatura predeterminadas sustancialmente constantes para congelar el material.

Las técnicas actuales de crioconservación implican usar equipo de enfriamiento criogénico basado en la conductividad tal como estante frío o unidad congeladora del tipo liofilizador o equipo de enfriamiento criogénico basado en convección tal como congeladores de velocidad controlada y unidades de criocongelador. Tales equipos, sin embargo, son solo apropiados para capacidades de relativamente pequeño volumen solo y no son apropiados para la producción y conservación a escala comercial de materiales biológicos tales como líneas celulares terapéuticas. Por ejemplo, el mayor congelador de velocidad controlada comercialmente disponible para su uso con materiales biológicos contiene solo alrededor de 8000 más o menos viales empaquetados compactamente. Tales congeladores de velocidad controlada existentes también adolecen de no uniformidad en el enfriamiento de vial a vial debido, en parte, al flujo no uniforme de criógeno dentro de los congeladores y al requerimiento de empaquetamiento compacto dentro del congelador.

Muchos sistemas de congelación convencionales utilizan ventiladores internos para dispersar el criógeno alrededor de la unidad y suministrar la refrigeración a los viales vía convección. Tales sistemas de enfriamiento o congelación basados en convección no pueden conseguir uniformidad de temperatura ya que los viales están a menudo colocados a distancias variables del ventilador interno o empaquetados en la sombra de otros viales o bandejas. Los viales de material biológico expuestos a flujo turbulento de alta velocidad de criógeno se enfrían típicamente a una velocidad diferente y a menudo mucha más rápida que los viales situados más alejados del ventilador.

También existen congeladores de velocidad controlada del tipo de liofilizador que pueden manejar grandes volúmenes de viales pero típicamente se basan en conducción térmica entre estantes fríos en la unidad liofilizadora y los viales. Sin embargo, es imposible hacer que el fondo de los viales de vidrio tenga un área superficial conductora uniforme dado que la mayoría de los fondos de los viales de vidrio son cóncavos. Por lo tanto, las variaciones de temperatura durante el procedimiento de congelación de vial a vial son el mayor inconveniente para estos tipos de equipo. Además, la velocidad de enfriamiento puede ser penosamente lenta debido a la muy pequeña superficie conductora del vial que permanece en contacto con los estantes fríos.

Los intentos previos para mitigar la pérdida de actividad y viabilidad celular implicaba el uso de aditivos crioprotectores tales como DSMO y glicerol. El uso de tales crioprotectores durante el procedimiento de crioconservación ha demostrado una reducción de pérdidas de células atribuibles a los ciclos de congelación y subsecuente descongelación. Sin embargo, muchos crioprotectores tales como DSMO son tóxicos para las células humanas y aparte de eso no son apropiados para su uso en terapias de células completas. Desventajosamente, los crioprotectores añaden también un grado de complejidad y coste asociado al procedimiento de producción y conservación celular. Además, los crioprotectores solos no han erradicado el problema de pérdida de actividad y viabilidad celular.

Lo que se necesita es un método y sistema para reducir o minimizar adicionalmente el daño celular que ocurre debido a la formación de hielo o a los efectos del soluto durante los procedimientos de crioconservación con o sin el uso de crioprotectores. Además, el sistema y método debe ser tanto eficiente como fácilmente escalable para manejar la producción y conservación a escala comercial de materiales biológicos y proporcionar enfriamiento rápido y uniforme de tal material biológico.

Sumario de la invención La presente invención puede ser caracterizada como un sistema de congelación o enfriamiento criogénico para materiales biológicos que incluye una fuente de criógeno, un circuito de entrada acoplado a la fuente de criógeno y adaptada para proporcionar un flujo uniforme de gas frío criogénico a una cámara de enfriamiento, un circuito de salida y un sistema de control. La cámara de enfriamiento comprende una cámara de entrada, un colector de salida, y dos o más superficies porosas paralelas que definen un área de enfriamiento entre superficies paralelas adyacentes con una de las superficies porosas paralelas dispuesta adyacente a la cámara de entrada y en comunicación fluida con la cámara de entrada y otra de las superficies porosas paralelas dispuestas adyacentes al colector de salida, las superficies porosas paralelas y área de enfriamiento están adaptadas para retener una pluralidad de recipientes de materiales biológicos. El circuito de salida del sistema de enfriamiento o congelación está adaptado para retirar el gas criogénico del colector de salida de la cámara de enfriamiento mientras que el sistema de control está adaptado para ajustar los caudales de la fuente de criógeno en el circuito de entrada y cualquier gas criogénico en el circuito de salida para ajustar la temperatura del gas criogénico frio suministrado a la cámara de enfriamiento en respuesta a una deseada velocidad de enfriamiento de los materiales biológicos y temperaturas medidas dentro de la cámara de enfriamiento. De esta manera, se suministra un flujo laminar, unidireccional y uniforme de gas frio criogénico de temperatura ajustada al área de enfriamiento entre las superficies porosas paralelas y cada uno de la pluralidad de recipientes para enfriar uniformemente los materiales biológicos.

La presente invención se puede caracterizar como método de congelación o enfriamiento a velocidad controlada de materiales biológicos que comprende las etapas de: (i) colocar una pluralidad de recipientes de los materiales biológicos en un área de enfriamiento definida como el área entre superficies porosas paralelas dentro de una cámara de enfriamiento; (ii) mezclar un líquido criogénico con un gas más caliente para producir un gas criogénico frio a un perfil de temperatura seleccionado, correspondiendo el perfil de temperatura a la velocidad... [Seguir leyendo]

1. Un congelador o sistema de congelación criogénico para materiales biológicos que comprende:

una fuente de criógeno (230, 240) ;

un circuito de entrada (12; 262) acoplado a la fuente de criógeno y adaptado para proporcionar un flujo uniforme de un gas frio criogénico a una cámara de enfriamiento (52; 220) ;

la cámara (52; 220) de enfriamiento que comprende una cámara (32; 266) de entrada, un colector (34; 225) de salida, y dos o más superficies (16, 19) porosas paralelas que definen un área (30) de enfriamiento entre superficies paralelas adyacentes con una de las superficies porosas paralelas dispuesta adyacente a la cámara de entrada y en comunicación fluida con la cámara de entrada y otra de las superficies porosas paralelas dispuesta adyacente al colector de salida, las superficies porosas paralelas y el área de enfriamiento adaptadas para retener una pluralidad de recipientes (20) de materiales biológicos;

un circuito (28) de salida adaptado para retirar el gas criogénico del colector (34) de salida de la cámara de enfriamiento; y

un sistema (70, 270) de control adaptado para ajustar los caudales de la fuente de criógeno en el circuito de entrada y de cualquier gas criogénico en el circuito de salida para ajustar la temperatura del gas criogénico frio suministrado a la cámara de enfriamiento en respuesta a una velocidad de enfriamiento deseada de los materiales biológicos y a las temperaturas medidas dentro de la cámara de enfriamiento;

en el que un flujo laminar, unidireccional y uniforme de gas frio criogénico a temperatura ajustada se suministra a un área de enfriamiento entre las superficies porosas paralelas y cada uno de la pluralidad de recipientes para enfriar uniformemente los materiales biológicos:

2. El sistema de la reivindicación 1, en el que la fuente de criógeno adicionalmente comprende un criógeno (230) líquido y un gas (240) más caliente.

3. El sistema de la reivindicación 2, en el que el circuito de entrada comprende adicionalmente un mezclador

(263) en línea adaptado para mezclar el criógeno líquido y gas más caliente para producir el gas frio criogénico (260) .

4. El sistema de la reivindicación 3, en el que el circuito de salida adicionalmente comprende un circuito (252) de recirculación que recircula gas del colector (225) de salida de nuevo al circuito (262) de entrada.

5. El sistema de la reivindicación 4, en el que el sistema (270) de control operativamente ajusta los caudales del criógeno líquido, el gas más caliente en el circuito (262) de entrada y circuito (252) de recirculación para ajustar la temperatura del gas criogénico frio suministrado a la cámara (220) de enfriamiento.

6. El sistema de la reivindicación 1, en el que el circuito (262) de entrada comprende adicionalmente uno o más orificios (265) de flujo crítico dispuestos aguas arriba de la cámara (226) de entrada para estrangular el flujo de gas frio criogénico a la cámara (220) de enfriamiento.

7. Un método de enfriamiento o congelación a velocidad controlada de materiales biológicos que comprende las etapas de:

colocar una pluralidad de recipientes (20) de los materiales biológicos en un área (30) de enfriamiento definida como el área entre superficies (16, 19) porosas paralelas dentro de una cámara de enfriamiento;

mezclar un criógeno (230) líquido con un gas (240) más caliente para producir un gas (260) criogénico frio a un perfil de temperatura seleccionado, correspondiendo el perfil de temperatura a una velocidad de enfriamiento deseada de los materiales biológicos dentro de los recipientes; y

suministrar un flujo laminar unidireccional del gas frio criogénico de temperatura ajustada a través de una de las superficies porosas al área de enfriamiento entre las superficies porosas paralelas y cada uno de la pluralidad de recipientes para enfriar uniformemente los materiales biológicos, y

expulsar con prontitud el gas de la cámara de enfriamiento vía otra superficie porosa paralela para evitar la recirculación del gas dentro del área de enfriamiento.

8. El método de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente la etapa de recircular el gas expulsado para mezclarlo con el gas más caliente.

9. El método de la reivindicación 7, que comprende adicionalmente la etapa de regular la presión y el caudal del gas frio criogénico de temperatura ajustada previamente a suministrar el flujo laminar unidireccional a través de las superficies (16, 19) porosas al área (30) de enfriamiento.