Método y medio para detectar la presencia o ausencia de Staphylococcus aureus en una muestra de ensayo.

Un método para detectar la presencia o ausencia de Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina ("MRSA") enuna muestra de ensayo de primera generación,

donde una muestra de ensayo de primera generación es una muestra de ensayo no tratada recogida directamente a partir de una muestra de ensayo biológica, ambiental o dealimento, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar una mezcla de ensayo que incluye constituyentes promotores del crecimiento que facilitan lamultiplicación de Staphylococcus aureus ("S. aureus"), sustratos de coagulasa con capacidad para reaccionarcon coagulasa producida por S. aureus para crear un coágulo, donde se incluyen plasma y fibrinógeno comouna fuente de sustratos de coagulasa y una cantidad de un inductor de gen MecA eficaz para destruir cualquierStaphylococcus Aureus Sensible a Meticilina ("MSSA") en la muestra de ensayo de primera generación;

b) inocular la mezcla de ensayo con la muestra de ensayo de primera generación;

c) incubar la mezcla de ensayo inoculada a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 ºC aaproximadamente 42 ºC, y

d) observar la mezcla de ensayo inoculada para observar la presencia o ausencia de un coágulo dentro de lamezcla inoculada.

Método y medio para detectar la presencia o ausencia de Staphylococcus aureus en una muestra de ensayo

Antecedentes de la invención

1. Información técnica

El presente método y mezcla de ensayo se refiere a la detección de Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina en una muestra biológica, ambiental o de alimento y más particularmente a aquellos métodos y mezclas de ensayo que utilizan factores de reacción que el microbio o los microbios diana pueden convertir en un coágulo.

2. Información de antecedentes

El Staphylococcus aureus (S. aureus) puede ser un agente patógeno virulento de animales y seres humanos. Además, el mismo puede provocar intoxicación alimentaria grave mediante la producción de una toxina. Las enfermedades causadas por S. aureus abarcan un espectro clínico muy amplio, desde infecciones dérmicas sencillas hasta infecciones con peligro para la vida de los huesos, corazón y órganos. El reconocimiento de que infección por S. aureus es común después de cirugía es de preocupación particular. El mismo también se asocia con tubos intravenosos y otros implantes.

La bacteria S. aureus se puede transmitir entre individuos sanos mediante contacto de piel a piel o desde un artículo o una superficie compartida de forma común (por ejemplo, camas de bronceado, equipo de gimnasio, equipo de manipulación de alimentos, etc.) donde la transferencia se puede realizar a una persona posterior que usa el artículo 25 compartido o toca la superficie. El reconocimiento de que personas sanas que entran en hospitales pueden “portar”

S. aureus (por ejemplo, en su piel, o en sus narices, etc.) sin ningún signo o síntoma de que los mismos lo portan es de gran preocupación médica. En presencia de condiciones favorables (encontradas con frecuencia, aunque sin limitación, en hospitales) , el S. aureus puede activar y provocar infección grave. Además, S. aureus también puede ser una fuente de intoxicación alimentaria, causada con frecuencia por un manipulador de alimentos que contamina el producto alimenticio (por ejemplo, carne, pollo, huevos, ensaladas que contienen mayonesa, productos de panadería, productos lácteos, etc.) .

Existen dos categorías de S. aureus en base a la sensibilidad de un clon individual frente a la clase de antibióticos que se inició con la meticilina. Estos son S. aureus sensibles a meticilina (MSSA) y S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) . Hasta hace unos pocos años, MRSA se encontraba más comúnmente en hospitales. Actualmente, muchos también están presentes en la nariz, piel, etc. de personas en la comunidad no hospitalaria. Adicionalmente, estos MRSA están provocando de forma creciente infecciones graves en la comunidad. MRSA es particularmente grave debido a que pocos antibióticos (por ejemplo, vancomicina) han demostrado ser eficaces de forma uniforme frente a MRSA.

El Centro para el Control y Prevención de Enfermedades estudia activamente el desarrollo de S. aureus resistente a meticilina. En el año 2000, las directrices de la Sociedad Estadounidense de Epidemiología Hospitalaria recomendaban el aislamiento de contacto para pacientes con MRSA. Adicionalmente a la morbilidad y mortalidad provocada por MRSA, se ha estimado que cada caso de infección cuesta al menos $23.000. Por consiguiente,

muchos hospitales y hogares de ancianos toman muestras de manera proactiva de los pacientes para MRSA [Clany, M., Active Screening in High-Risk units is an effective and cost-avoidant method to reduce the rate of methicillinresistant Staphylococcus aureus infection in the hospital., Infection Control and Hospital Epidemiology 27: 10091017, 2006].

Meyer et al. (Patente de Estados Unidos Nº 4.035.238) describen el uso de un caldo para la detección de S. aureus que utilizaba manitol como una fuente de carbono y verde de metilo de ADN como un indicador. Ninguno de estos agentes químicos son sustratos reactivos a coagulasa.

Rambach (Patente de Estados Unidos Nº 6.548.268) emplea al menos dos agentes cromógenos en un medio de 55 agar: 5-bromo-6-cloro-indoxil-fosfato; y 5-bromo-4-cloro-3-indoxil glucosa en presencia de deferoxamina. Una colonia individual que hidroliza estos sustratos producirá colores que se mezclarán entre sí y que no serán independientes los unos de los otros.

Se utiliza un gran número de procedimientos de cultivo clásico para detectar MSSA y MRSA a partir de muestras humanas, animales, alimentos, etc. Los mismos tienen en común un medio básico con inhibidores químicos tal como cloruro de sodio al 6-8%, telurito de potasio y una diversidad de antibióticos. Por ejemplo Stevens y Jones describieron el uso de un agar de trehalosa-manitol-fosfatasa [Stevens, DL y Jones, C. Use of trehalose-mannitolphosphatase agar to differentiate Staphylo-coccus epidermidis and Staphylococcus saprophyticus from other coagulase-negative staphylococci, J. of Clin. Micro-biology 20: 977-980, 1984]. El uso de manitol como una fuente de 65 carbono y sal como un agente selectivo en un agar conocido como agar manitol sal se ha usado comúnmente en laboratorios clínicos [Baird, R. M. y W. H. Lee., Media used in the detection and enumeration of Staphylococcus aureus., Int. J. Food Microbiology. 26: 209-211, 1995]. Dentro de la técnica anterior de cultivo, es un procedimiento generalmente aceptado llevar a cabo ensayos de coagulasa que utilizan muestras de S. aureus que se aíslan en un cultivo puro.

El procedimiento “ID de S. aureus” [Bio Merieux, La Balme Les Grottes, Francia] usa un sustrato de alfa glucosidasa en agar para detectar S. aureus. Se utiliza un sustrato único. [Perr y , J. D. et al., Evaluation of S. aureus ID, a new chromogenic agar medium for detection of Staphylococcus aureus, J. Clin. Microbiology 41: 5695-5698, 2003]. Una variante de este medio, que contiene antibióticos y cloruro de sodio añadidos, se diseña para detectar MRSA [Perr y et al., Development and evaluation of a chromogenic agar medium for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, J. of Clin. Micro. 42: 4519-4523, 2004].

Selepak y Witebsky divulgan un estudio que evalúa el tamaño de inóculo y la variabilidad de lote a lote del ensayo de coagulasa en tubo para S. aureus. Las muestras de ensayo se recogieron y se generaron aislados a partir de colonias bacterianas en placas de agar. Tubos que contenían plasma de coagulasa de conejo anticoagulado se inocularon con una parte de, o más de una, colonia estafilocócica a partir de los aislados. Los tubos se incubaron y se examinaron para determinar la presencia de coágulo. De acuerdo con Selepak y Witebsky, “con algunos aislados y algunos lotes de plasma de coagulasa, incluso una colonia única [a partir del aislado] puede no proporcionar inóculo suficiente para un ensayo de coagulasa positivo”. Además, Selepak y Witebsky indican que “[e]xpresado de forma más cuantitativa, al menos 108 organismos por ml se deberían usar siempre que sea posible para cada ensayo de tubo de coagulasa. Nuestros datos sugieren además que S. aureus no crece en plasma de coagulasa; por lo tanto, la incubación de plasma de coagulasa durante 18 a 24 h no compensa el uso de inóculo pequeño”. Por tanto, Selepak y Witebsky indican que es poco práctico, si no imposible, detectar la presencia o ausencia de S. aureus en muestras de ensayo biológicas de primera generación usando un ensayo de coagulasa directo. [Selepak, S. T et al, “Inoculum Size and Lot-to-Lot Variation as Significant Variables in the Tube Coagulase Test for

Staphylococcus aureus”, Journal of Clin. Microbiology, Nov. 1985, pág. 835-837]. Yazdankhah (Yazdankhah S P et al.: “Simple and direct detection of Staphylococcus aureus in milk by a tube coagulase test.”, Letters in Applied Microbiology, 1998, vol. 27, Nº 2, Agosto 1998 (1998-08) , páginas 111-115) describe un ensayo de coagulasa en tubo (TCT) como un sistema sencillo y no costoso para la detección de Staphylococcus aureus directamente en leche. El procedimiento se caracteriza por la mezcla de muestras de leche con plasma de citrato de conejo seguido por incubación a 37 ºC para formación de coágulo. El ensayo de coagulasa en tubo demostró una precisión del 91, 5%, una sensibilidad del 88, 5% y una especificidad del 100% para el reconocimiento directo de Staphylococcus aureus en muestras de leche a partir de cuartos con mastitis subclínica, en comparación con la siembra en placas de leche en agar sangre. Lominski (Lominski I et al. “An improved direct coagulase test for the rapid detection of Staphylococcus aureus.”,

British medical journal 1948, vol. 116, Nº 4546, 1948, página 343) sugiere un método para la detección rápida de Staphylococcus aureus que consiste en añadir... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar la presencia o ausencia de Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina (“MRSA”) en una muestra de ensayo de primera generación, donde una muestra de ensayo de primera generación es una muestra de ensayo no tratada recogida directamente a partir de una muestra de ensayo biológica, ambiental o de alimento, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar una mezcla de ensayo que incluye constituyentes promotores del crecimiento que facilitan la multiplicación de Staphylococcus aureus (“S. aureus”) , sustratos de coagulasa con capacidad para reaccionar

con coagulasa producida por S. aureus para crear un coágulo, donde se incluyen plasma y fibrinógeno como una fuente de sustratos de coagulasa y una cantidad de un inductor de gen MecA eficaz para destruir cualquier Staphylococcus Aureus Sensible a Meticilina (“MSSA”) en la muestra de ensayo de primera generación; b) inocular la mezcla de ensayo con la muestra de ensayo de primera generación; c) incubar la mezcla de ensayo inoculada a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 ºC a aproximadamente 42 ºC, y d) observar la mezcla de ensayo inoculada para observar la presencia o ausencia de un coágulo dentro de la mezcla inoculada.

2. El método de la reivindicación 1 donde la mezcla de ensayo se hidrata antes de llevar a cabo la etapa de inocular 20 la mezcla de ensayo con la muestra de ensayo de primera generación.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde el plasma es plasma de conejo.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde los constituyentes promotores del crecimiento

incluyen uno o más de los siguientes: una fuente de nitrato, una fuente de proteína, un material con capacidad para ayudar a la generación de síntesis de ácido nucleico y una fuente de energía para el S. aureus y una fuente de factor de crecimiento de aminoácidos.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la mezcla de ensayo incluye:

a) una cantidad eficaz de aminoácidos; b) una cantidad eficaz de fuentes de nitrógeno; c) una cantidad eficaz de sales; d) una cantidad eficaz de vitaminas;

e) una cantidad eficaz de calcio;

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo además la etapa de recoger la muestra de primera generación mediante uno de: a) hisopado de un conducto nasal de un sujeto humano; b) hisopado de una superficie ambiental; y c) toma de muestras de una muestra de ensayo de alimento.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la mezcla de ensayo es una mezcla seca capaz de hidratarse.

8. Una mezcla de ensayo para su uso en la detección de la presencia o ausencia de Staphylococcus Aureus

Resistente a Meticilina (“MRSA”) en una muestra de ensayo de primera generación, donde una muestra de ensayo de primera generación es una muestra de ensayo no tratada recogida directamente a partir de una muestra de ensayo biológica, ambiental o de alimento, comprendiendo la mezcla de ensayo:

a) una cantidad eficaz de aminoácidos;

b) una cantidad eficaz de fuentes de nitrógeno; c) una cantidad eficaz de sales; d) una cantidad eficaz de vitaminas; e) una cantidad eficaz de calcio; f) una cantidad eficaz de sustratos de coagulasa con capacidad para producir un coágulo dentro de la mezcla 55 de ensayo en presencia de S. aureus en la muestra de ensayo de primera generación y donde se incluyen plasma y fibrinógeno como una fuente de sustratos de coagulasa; g) una cantidad de un inductor de gen MecA eficaz para destruir cualquier Staphylococcus Aureus Sensible a Meticilina (“MSSA”) en la muestra de ensayo de primera generación.

9. La mezcla de ensayo de la reivindicación 8, donde el inductor de gen MecA es cefoxitina.

10. La mezcla de ensayo de la reivindicación 8 o 9, donde el plasma es plasma de conejo.

11. La mezcla de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la mezcla de ensayo es un líquido. 65 12. La mezcla de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la mezcla de ensayo es una mezcla seca que es capaz de hidratarse.