Método y aparato para el ensayo simultáneo de varios analitos con un control interno.

Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas en medicina humana,

medicina veterinaria o en diagnósticos vegetales, diagnósticos de alimentos, diagnósticos ambientales, diagnósticos forenses, farmacología, toxicología, enfermedades autoinmunológicas o metabólicas, enfermedades infecciosas, enfermedades genitales, enfermedades parasitarias, en la determinación de moléculas pequeñas tales como fármacos, medicaciones o metabolitos, mediadores celulares, en el tipado de tejidos, tipado de especies, tipado de alimentos, tipado de antígenos, tipado de epítopos y en la detección de ADN o ARN, caracterizado por:

a) como mínimo dos áreas superficiales en una superficie del dispositivo están provistas de moléculas inmovilizadas o clases de moléculas, en el que un área superficial se utiliza con fines de control o de estandarización, y el otro área superficial se utiliza para detectar un analito, en el que:

b) las dos superficies se encuentran estructuradas de manera que entran en contacto esencialmente en el mismo punto temporal con una muestra entera de la que deben determinarse algunas moléculas o o clases de moléculas o mezclas de moléculas, y

c) en el que ambas áreas superficiales se encuentran estructuradas y dispuestas una respecto a otra de manera que se evalúan conjuntamente mediante la formación de una disposición gráfica que puede leerse visualmente, y

d) en el que las áreas superficiales se disponen en un sistema de coordenadas o matriz y pueden ser evaluadas a ojo desnudo, y

e) en el que dicho dispositivo se diseña en forma de recipiente,

f) en el que las áreas superficiales están representadas por una pluralidad de símbolos de manera lineal o en una matriz que se dispone de una manera diferente.

Método y aparato para el ensayo simultáneo de varios analitos con un control interno La presente invención se refiere a un dispositivo para detectar moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas en las que por lo menos dos superficies son modificadas química o físicamente en un panel del dispositivo de manera que se proporcionen a dichas superficies medios para inmovilizar moléculas o clases y/o mezclas de moléculas, en las que se utiliza una superficie con fines de control o estandarización, y la otra sirve para detectar un analito, en las que se estructuran las dos superficies de manera que entran en contacto (principio de ensayo de contacto tangencial) en esencialmente el mismo punto temporal con una matriz completa de muestras de la que las moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas deben someterse a ensayo, y en la que ambas superficies están estructuras y dispuestas mutuamente de manera que se evalúan conjuntamente, formando de esta manera una disposición gráfica que puede leerse visualmente. Según la invención, las parejas de símbolos pueden hacerse visibles: "-" significa negativo y "+" significa positivo, o un círculo significa negativo y un círculo con uno o más puntos significa positivo. Pueden proporcionarse anticuerpos, antígenos, ADN, ARN, enzimas, sustratos, receptores, ligandos o combinaciones de los mismos como medios para inmovilizar moléculas o clases y/o mezclas de moléculas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La totalidad de las referencias citadas en la presente memoria se incorporan como referencia en su totalidad para los fines de la presente invención.

En los campos de la investigación, medicina, biología, química y toxicología, así como en muchas otras áreas de aplicación, los ensayos analíticos de laboratorio que sirven para someter a ensayo cualitativa y/o cuantitativamente las moléculas o su activación o composición constituyen la base para descripciones detalladas, e incluso para el desarrollo de nuevos métodos o dispositivos. Son ejemplos de lo anterior, los métodos analíticos de la biología molecular, los cuales se utilizan en investigación, en técnicas forenses para la investigación de crímenes o en medicina para la detección de la presencia de cáncer. La base para ello comprende los métodos generalmente conocidos de análisis de ADN/ARN o el análisis de las proteínas. Otro ejemplo es el amplio abanico de procedimientos y métodos analíticos que se utilizan para examinar las reacciones de anticuerpos, las denominadas reacciones inmunológicas, las cuales sirven para someter a ensayo para gérmenes, proteínas, fármacos y muchas otras sustancias. Estos procedimientos analíticos presentan un área de aplicación muy amplia. Se utilizan en los campos de la medicina, de la investigación y de la tecnología de los productos alimentarios y farmacéuticos.

A lo largo de los años, estas técnicas de laboratorio han sido consistentemente afinadas a través del amplio abanico de usos analíticos del ADN/ARN, las proteínas y otras moléculas. Lo anterior ha llevado a éxitos cada vez mayores, expandiendo las áreas de aplicación. La consecuencia ha sido un número cada vez mayor de muestras que pueden examinarse sistemáticamente para moléculas específicas. Debido a que un gran número de muestras individuales sólo puede examinarse con un esfuerzo considerable, en la actualidad se utilizan los denominados robots de laboratorio o, más recientemente, las tecnologías denominadas de chip, las cuales son capaces de examinar simultáneamente hasta varios cientos de muestras.

En contraste con estos exigentes métodos de examen de laboratorio (patente EP nº 1 338 895, titulada "High-density allergen microarray" (Micromatriz de alérgenos de alta densidad) o patente EP nº 0 875 758 B1, titulada "Immunoassay" (Inmunoensayo) ) , los ensayos denominados rápidos, los cuales proporcionan a los médicos y terapeutas resultados de análisis rápidos y simples que se limitan a los puntos esenciales, se están utilizando cada vez con mayor frecuencia. Existe una gran demanda y ésta está creciendo continuamente. Estos ensayos con frecuencia se utilizan en el área denominada "de punto de cuidado", es decir, inmediatamente antes, durante o después de las medidas terapéuticas. Otro objetivo es proporcionar una alternativa eficaz en cuanto a costes a los ensayos de laboratorio clásicos. Sin embargo, la fiabilidad de la aplicación y/o el número de analitos que pueden someterse a ensayo simultáneamente, así como la precisión analítica, son muy limitados. Existe una gran necesidad de mejoras en este campo.

Se conocen métodos de ensayo rápidos, tales como el ensayo de flujo lateral (EFL) , el ensayo de flujo continuo (EFC) , el ensayo de aglutinación (EA) y el ensayo en fase sólida (EFS) . La totalidad de dichos métodos sirven para detectar con rapidez los analitos sin utilizar instrumentos y resultan adecuados para la evaluación visual. La totalidad de dichos métodos presenta desventajas y por lo tanto sólo pueden sustituir parcialmente los ensayos de laboratorio o sólo pueden ser utilizados por personas no expertas en un grado limitado. Por ello, estos métodos en ocasiones se refuerzan con medios técnicos. Pueden encontrarse ejemplos de estos métodos, entre otros, en las memorias de patente DE nº 197 21151, EP nº 98 928 265.5, WO nº 98/53321, titulada "Streifentest zur in vitro Allergiediagnostik” [Strip test for in vitro allergy diagnosis] (Ensayo de tira para el diagnóstico in vitro de alergias) ; WO nº 03/094716, US nº 2003-212316, titulado "Method and apparatus for determining blood parameters and vital signs of a patient” [Método y aparato para determinar parámetros sanguíneos y signos vitales en un paciente]; WO nº 02/084249, titulado “Therapeutic and diagnostic uses of antibody specificity profiles” [Usos terapéuticos y diagnósticos de perfiles de especificidad de anticuerpos]; WO nº 00/40967, titulado “Method and device for diagnosing allergy symptoms” [Método y dispositivo para el diagnóstico de los síntomas de alergia]; WO nº 02/066602, EP nº 135011.1; WO nº 93/10458, titulado “Binding of milk allergens to a solid phase” [Unión de alérgenos de la leche a una fase sólida]; patente US nº 6.528.325, WO nº 02/056017, titulado “Method for the visual detection of specific antibodies in human serum by the use of lateral flow assays” [Método para la detección visual de anticuerpos específicos en suero humano mediante la utilización de ensayos de flujo lateral]; EP nº 1327884, titulado “Reagent test strip comprising control means and timer means” [Ensayo de tira reactiva que comprende medios de control y medios de medición del tiempo]; WO nº 97/31268, titulado “Chromatographic strip having detection and control zones oriented parallel to the direction of flow” [Tira cromatográfica que presenta zonas de detección y de control orientadas en paralelo a la dirección de flujo]; patente US nº 6.040.195, titulada “Diagnostic sanitar y test strip” [Tira de ensayo sanitario diagnóstica]; patente US nº 6.509.196, WO nº 01/50129, titulado “Compensation for non-specific signals in quantitative immunoassays” [Compensación de las señales no específicas en inmunoensayos cuantitativos].

Los EFL son los ensayos rápidos más extendidos. En ellos, la muestra, por ejemplo suero u orina, se aplica sobre una superficie. De una manera directamente comparable con la cromatografía de capa fina, el líquido (muestra) fluye a través de una capa de separación que contiene reactivos tales como, por ejemplo, anticuerpos marcados, y posteriormente fluye a través de una capa de nitrocelulosa. La capa de nitrocelulosa contiene capas de captura (en contraste con el EFS, en el que las capas de captura se encuentran presentes sobre la superficie del portador) a las que se unen los anticuerpos marcados, formando una línea que es visible al ojo. Dichos métodos fueron descritos en la literatura científica antes de 1980, tanto para la utilización en la cromatografía de capa fina clásica como en un ensayo rápido. Las únicas diferencias son en la utilización de un reactor estandarizado o de una capa de separación que puede utilizarse universalmente múltiples veces.

El EFC es comparable a la cromatografía de columna. En este ensayo, la muestra (líquido) fluye a través de capas de membranas y capas de succión. Al igual que el EFL, por ejemplo, los anticuerpos que son capaces de unirse a analitos se unen a la membrana de detección. Los analitos unidos se hacen visibles como puntos mediante diversos reactivos de detección. Dichos métodos fueron descritos en la literatura científica antes de 1980, para la utilización como cromatografía... [Seguir leyendo]

1. Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas en medicina humana, medicina veterinaria o en diagnósticos vegetales, diagnósticos de alimentos, diagnósticos ambientales, diagnósticos forenses, farmacología, toxicología, enfermedades autoinmunológicas o metabólicas, enfermedades infecciosas, enfermedades genitales, enfermedades parasitarias, en la determinación de moléculas pequeñas tales como fármacos, medicaciones o metabolitos, mediadores celulares, en el tipado de tejidos, tipado de especies, tipado de alimentos, tipado de antígenos, tipado de epítopos y en la detección de ADN o ARN, caracterizado por:

a) como mínimo dos áreas superficiales en una superficie del dispositivo están provistas de moléculas inmovilizadas o clases de moléculas, en el que un área superficial se utiliza con fines de control o de estandarización, y el otro área superficial se utiliza para detectar un analito, en el que:

b) las dos superficies se encuentran estructuradas de manera que entran en contacto esencialmente en el mismo punto temporal con una muestra entera de la que deben determinarse algunas moléculas o o clases de moléculas o mezclas de moléculas, y

c) en el que ambas áreas superficiales se encuentran estructuradas y dispuestas una respecto a otra de manera que se evalúan conjuntamente mediante la formación de una disposición gráfica que puede leerse visualmente, y

d) en el que las áreas superficiales se disponen en un sistema de coordenadas o matriz y pueden ser evaluadas a ojo desnudo, y

e) en el que dicho dispositivo se diseña en forma de recipiente,

f) en el que las áreas superficiales están representadas por una pluralidad de símbolos de manera lineal o en una matriz que se dispone de una manera diferente.

2. Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas según la reivindicación 1, caracterizado porque las áreas superficiales presenta una disposición plana y/o espacial unas respecto a otras.

3. Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las áreas superficiales están representadas por uno o más símbolos de una manera lineal o en una matriz que se dispone de una manera diferente.

4. Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las moléculas inmovilizadas o clases de moléculas se evalúan conjuntamente de manera visual mediante una reacción de detección sin medios técnicos adicionales, en el que las diversas áreas superficiales presentan una apariencia coloreada, negra o gris o en una mezcla de colores y/o tonos de gris.

5. Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el dispositivo está diseñado en forma de recipiente que comprende una o más aberturas.

6. Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas según la reivindicación 5, caracterizado porque las áreas superficiales se sitúan en el interior del recipiente o una o más áreas superficies se sitúan sobre las paredes del recipiente.

7. Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque las áreas superficiales se hacen visibles como símbolos, "-" significa negativo y "+" significa positivo, o un círculo significa negativo y un círculo con uno o más puntos en el interior significa positivo.

8. Dispositivo para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las moléculas o clases y/o mezclas de moléculas inmovilizadas se seleccionan de entre el grupo que consiste de anticuerpos, antígenos, ADN, ARN, enzimas, sustratos, receptores, ligandos o combinaciones de los mismos.

9. Método para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas en medicina humana, medicina veterinaria o en diagnósticos vegetales, diagnósticos de alimentos, diagnósticos ambientales, diagnósticos forenses, farmacología, toxicología, enfermedades autoinmunológicas o metabólicas, enfermedades infecciosas, enfermedades genitales, enfermedades parasitarias, la determinación de moléculas pequeñas tales como fármacos, medicaciones o metabolitos, mediadores celulares, en el tipado de tejidos, tipado de especies, tipado de alimentos, tipado de antígenos, tipado de epítopos y en la detección de ADN o ARN, comprendiendo las etapas siguientes:

a) establecer contacto entre una muestra de la que deben determinarse algunas moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas y una superficie de un dispositivo, de manera que este dispositivo entra en contacto esencialmente de manera simultánea con la muestra entera de la que deben determinarse moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas, en el que como mínimo dos áreas superficiales en la superficie del dispositivo están provistas de moléculas o clases y/o mezclas de moléculas inmovilizadas de manera que un área superficial se proporciona con fines de control o de estandarización, y la otra se proporciona para la detección de un analito, y en el que ambas áreas superficiales están estructuradas y dispuestas una respecto a otra de manera que se evalúan conjuntamente mediante la formación de una disposición gráfica que puede leerse visualmente, y

b) leer y evaluar las áreas superficiales basándose en un sistema de coordenadas o matriz,

en el que dicho dispositivo ha sido diseñado en forma de recipiente y las áreas superficiales están representadas por una pluralidad de símbolos de manera lineal o en una matriz que se dispone de una manera diferente.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque las áreas superficiales se leen en plano y/o espacialmente.

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque las áreas superficiales se leen como uno o más símbolos de una manera lineal o en una matriz que se dispone de una manera diferente.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado por que las áreas superficiales se hacen visibles como símbolos, "-" significa negativo y "+" significa positivo, o un círculo significa negativo y un círculo con uno o más puntos en el interior significa positivo.

13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque se hacen visibles símbolos que consisten de varios círculos concéntricos que presentan un punto central, apareciendo dicho punto únicamente en caso de detección positiva, y en el que cada círculo individual sólo se hace visible a una concentración superior a determinado valor de concentración del analito o se hace visible cada una de las puntas de una estrella a una concentración superior a determinado valor de concentración y, en el caso positivo, aparece un punto predefinido o los puntos individuales detectan varios analitos y aparece un punto a una concentración superior a determinado valor de concentración, o una combinación de dichos símbolos.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque se utiliza a modo de muestra sangre completa, sangre capilar, sangre de cordón umbilical, sangre completa arterial o venosa, suero, plasma, orina, heces, lágrimas, saliva, moco, soluciones colorantes, soluciones que contienen constituyentes sólidos o líquidos de alta viscosidad.

15. Utilización de un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la detección de moléculas o clases de moléculas o mezclas de moléculas en medicina humana, medicina veterinaria o en diagnósticos vegetales, diagnósticos de alimentos, diagnósticos ambientales, diagnósticos forenses, farmacología, toxicología, enfermedades autoinmunológicas o metabólicas, enfermedades infecciosas, enfermedades genitales, enfermedades parasitarias, la determinación de moléculas pequeñas tales como fármacos, medicaciones o metabolitos, mediadores celulares, en el tipado de tejidos, tipado de especies, tipado de alimentos, tipado de antígenos, tipado de epítopos y en la detección de ADN o ARN.