Método para medir la concentración de un anticoagulante de glicosaminoglicano.

Un método de limpieza de una unidad de equipo de fabricación utilizada en la preparación de heparinade bajo peso molecular (HBPM) para obtener una concentración residual aceptable de HBPM quecomprende:

(a) someter la unidad de equipo de fabricación a un protocolo de limpieza;

(b) obtener la absorbencia de una muestra obtenida del equipo de fabricación, quecomprende las siguientes etapas:

(i) tomar una muestra del equipo de fabricación;

(ii) hacer reaccionar la muestra con azul de 1,9 dimetilmetileno; y

(iii) determinar la absorbencia de la muestra que se ha hecho reaccionar con azul de 1,9dimetilmetileno;

(c) determinar la concentración de HBPM en la muestra obtenida del equipo de fabricaciónmediante la comparación de su absorbencia con las absorbencias de una serie demuestras de HBPM de control en soluciones acuosas de concentraciones conocidas; y

(d) repetir de modo eventual las etapas (a)-(c) hasta que la concentración de HBPM en lamuestra obtenida del equipo de fabricación sea inferior a la concentración residualaceptable de HBPM.

Método para medir la concentración de un anticoagulante de glicosaminoglicano

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las heparinas de bajo peso molecular (HBPM) son un tipo importante de compuestos antitrombóticos. Las HBPM son seguras y eficaces para la prevención y el tratamiento del tromboembolismo venoso y muchas están aprobadas para estos usos en Europa y América del Norte. Las HBPM tienen la ventaja de que pueden administrarse por vía subcutánea y no necesitan control del tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) . Por tanto, las HBPM permiten el tratamiento externo de enfermedades como la trombosis venosa profunda y la embolia pulmonar que anteriormente requerían hospitalización.

Las HBPM son glicosaminoglicanos compuestos de cadenas de residuos alternos de D-glucosamina y uno de los dos ácidos urónicos: ácido urónico, ya sea ácido glucurónico o ácido idurónico. Mientras que la heparina no fraccionada es una mezcla heterogénea de cadenas de polisacáridos cuyo peso molecular varía entre aproximadamente 3.000 y 30.000, las HBPM (que a menudo están producidas por una depolimerización enzimática o química de heparina) tienen pesos promedios moleculares de aproximadamente 5.000. Todas las heparinas derivan su actividad anticoagulante de la antitrombina activadora (conocida anteriormente como antitrombina III) . Esta activación está determinada por una secuencia de pentasacáridos única que se distribuye de manera aleatoria a lo largo de las cadenas de heparinas. Aproximadamente un tercio de las cadenas de heparina no fraccionada, pero solo del 15 al 25 por ciento de las cadenas de las HBPM, contienen la secuencia de pentasacárido.

Existen diferencias entre la heparina no fraccionada y las HBPM en relación con el efecto inhibitorio sobre el factor Xa y la trombina. Cualquier cadena de heparina que contiene pentasacáridos puede inhibir la acción del factor Xa simplemente ligándose a la antitrombina. No obstante, para inactivar la trombina, la heparina debe formar un complejo terciario, uniéndose tanto a antitrombina como a trombina. Dichos complejos sólo se forman con heparina que contiene pentasacáridos. Puesto que menos de la mitad de las moléculas de HBPM tienen la longitud suficiente para unirse a la antitrombina y a la trombina, las HBPM tienen menos efecto sobre la trombina. Además, la HBPM muestra mejor actividad contra el factor Xa. La importancia relativa de la inhibición del factor Xa y de la inhibición de trombina en la mediación de un efecto antitrombótico varía con el marco clínico, pero existen pruebas de que ambas son necesarias. En consecuencia, ha aumentado el uso de las HBPM para la terapia de enfermedades con un elevado riesgo de coágulos sanguíneos.

Normalmente, las HBPM se formulan para uso clínico en soluciones acuosas. Debido a su potente efecto anticoagulante, es necesario controlar con exactitud las concentraciones de HBPM durante su formulación y envasado como productos farmacéuticos. Además, la capacidad para medir la concentración de una muestra experimental es fundamental para cualquier programa de desarrollo e investigación que busque inventar nuevos anticoagulantes de glicosaminoglicano.

Antes de la presente invención, dichas mediciones han necesitado el uso de técnicas basadas en el índice de refracción y absorción de luz UV. No obstante, el uso de la absorción UV es complicada por el hecho de que algunas HBPM producen sólo una señal UV muy débil que es casi indetectable. Además, los métodos UV requieren grandes cantidades de material de prueba lo que los convierte en poco prácticos, especialmente cuando los volúmenes de muestras son restrictivos. Además, la absorción UV no se adapta fácilmente al formato de ensayo rápido cuantitativo de volumen elevado. De modo similar, las técnicas basadas en el índice de refracción carecen de especificidad y pueden producir resultados artificialmente elevados. Dichas inexactitudes son particularmente indeseables cuando se miden los niveles de fármacos.

Por tanto, continua existiendo la necesidad de determinar métodos que puedan medir la concentración de anticoagulantes de glicosaminoglicano, como las HBPM, en solución que son cuantitativos con precisión,

rápidos, de realización sencilla y se prestan al alto rendimiento.

US20020009782 presenta un método para medir los anticoagulantes de glicosaminoglicanos de bajo peso molecular que utilizan azul de 1, 9 dimetilmetileno, lo que determina la absorbencia de la muestra y compara los resultados con un estándar de referencia. El documento también muestra métodos para obtener anticoagulantes de glicosaminoglicano de bajo peso molecular.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención ofrece un método para limpiar una unidad de equipo de fabricación utilizada en la preparación de una heparina de bajo peso molecular (HBPM) para obtener una concentración residual aceptable de HBPM que comprende:

(a) someter la unidad de equipo de fabricación a un protocolo de limpieza;

(b) obtener la absorbencia de una muestra obtenida de un equipo de fabricación que comprende: (i) tomar una muestra del equipo de fabricación; (ii) hacer reaccionar la muestra con azul de 1, 9 dimetilmetileno; y (iii) determinar la absorbencia de la muestra que se ha hecho reaccionar con azul de

1, 9 dimetilmetileno;

(c) determinar la concentración de HBPM en la muestra obtenida del equipo de fabricación mediante la comparación de su absorbencia con las absorbencias de una serie de muestras de HBPM de control en soluciones acuosas de concentraciones conocidas; y

(d) repetir de modo eventual las etapas (a) - (d) hasta que la concentración de HBPM en la muestra 10 obtenida del equipo de fabricación sea inferior a la concentración residual de HBPM.

La presente invención también se refiere a un método para limpiar una unidad de equipo de fabricación utilizada en la preparación de una heparina de bajo peso molecular (HBPM) para obtener una concentración residual aceptable de HBPM que comprende:

(a) someter la unidad de equipo de fabricación a un protocolo de limpieza;

(b) obtener la absorbencia de una muestra obtenida de un equipo de fabricación que comprende: (i) tomar una muestra del equipo de fabricación; (ii) hacer reaccionar la muestra con azul de 1, 9 dimetilmetileno; y (iii) determinar la absorbencia de la muestra que se ha hecho reaccionar con azul de 1, 9 dimetilmetileno;

(c) determinar la concentración de HBPM en la muestra obtenida del equipo de fabricación mediante la comparación de su absorbencia con las absorbencias de una serie de muestras de HBPM de control en soluciones acuosas de concentraciones conocidas; y

(d) determinar la concentración de HBPM en la muestra obtenida del equipo de fabricación; y

(e) repetir de modo eventual las etapas (a) - (d) hasta que la concentración de HBPM en la muestra obtenida del equipo de fabricación sea inferior a la concentración residual de HBPM.

El método puede llevarse a cabo según la invención en cualquier recipiente de ensayo adecuado, por ejemplo, en una placa de microvaloración o una cubeta. En consecuencia, el método se realiza de acuerdo con la invención es adecuado, cuantitativo, rápido, de realización sencilla y se presta al alto rendimiento.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS [0011] La FIG. 1 es un diagrama esquemático de una unidad de equipo de fabricación para producir HBPM.

La FIG. 2 representa una curva estándar ilustrativa generada según la invención empleando condroitín-4sulfato (C-4-S) . [0013] La FIG. 3 representa una curva estándar de ejemplo obtenida según la invención generada con enoxaparina y dalteparina (estándares de referencia proporcionados por la Dirección europea de calidad del medicamento) . 35 [0014] La FIG. 4A representa la saturación de la curva de respuestas a las dosis de enoxaparina. [0015] La FIG. 4B representa la saturación de la curva de respuestas a las dosis de dalteparina.

La FIG. 5 representa los resultados obtenidos al analizar las HBPM y los no anticoagulantes. [0017] La FIG. 6 representa los resultados generados por el método creativo para soluciones Arixtra®, Lovenox® y Fragmin® de varias concentraciones conocidas.

La FIG. 7 representa la estabilidad de la solución a las 24 horas para Arixtra®, Lovenox® y Fragmin®. [0019] La FIG. 8A representa el primer grupo de resultados obtenidos de un análisis de concentraciones de HBPM residual después de la limpieza de una unidad de equipo de facturación de acuerdo con un protocolo de limpieza.

La FIG. 8B representa el segundo grupo de resultados obtenidos de un análisis de concentraciones de HBPM residual... [Seguir leyendo]

1. Un método de limpieza de una unidad de equipo de fabricación utilizada en la preparación de heparina de bajo peso molecular (HBPM) para obtener una concentración residual aceptable de HBPM que comprende:

(a) someter la unidad de equipo de fabricación a un protocolo de limpieza;

(b) obtener la absorbencia de una muestra obtenida del equipo de fabricación, que comprende las siguientes etapas:

(i) tomar una muestra del equipo de fabricación;

(ii) hacer reaccionar la muestra con azul de 1, 9 dimetilmetileno; y

(iii) determinar la absorbencia de la muestra que se ha hecho reaccionar con azul de 1, 9 dimetilmetileno;

(c) determinar la concentración de HBPM en la muestra obtenida del equipo de fabricación mediante la comparación de su absorbencia con las absorbencias de una serie de muestras de HBPM de control en soluciones acuosas de concentraciones conocidas; y

(d) repetir de modo eventual las etapas (a) - (c) hasta que la concentración de HBPM en la muestra obtenida del equipo de fabricación sea inferior a la concentración residual aceptable de HBPM.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las absorbencias se determinan en una placa de microvaloración o una cubeta.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la HBPM de prueba tiene un peso medio molecular inferior a aproximadamente 10.000 daltons.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la HBPM de prueba tiene un peso medio molecular inferior a aproximadamente 7.000 daltons.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la HBPM de prueba tiene un peso medio molecular inferior a 25 aproximadamente 3.000 daltons.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la heparina de bajo peso molecular es seleccionada del grupo que consta de: ardeparina, bemiparina, dalteparina, enoxoparina, fondaparinux, nadroparina, reviparina, tinzaparina o intimatan, o combinaciones de las mismas.

7. El método de la reivindicación 1, en el que en la etapa (c) la absorbencia de la muestra de HBPM se

compara con una curva estándar de absorbencias obtenida de varias pruebas que tienen concentraciones conocidas de HBPM.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la curva estándar de absorbencias de muestras que tienen concentraciones conocidas de HBPM se obtiene mediante un proceso que comprende:

(a) preparar una serie de muestras de concentración conocida de HBPM;

(b) hacer reaccionar las muestras de concentración conocida de HBPM con azul de 1, 9 dimetilmetileno;

(c) determinar la absorbencia de las muestras de concentración conocida de HBPM que se han hecho reaccionar con azul de 1, 9 dimetilmetileno; y

(d) representar en gráficas las absorbencias obtenidas en (c) en relación con las 40 concentraciones conocidas de HBPM de las muestras correspondientes.

9. El método de la reivindicación 1, en el que una serie de muestras se obtienen del equipo de fabricación, en el que varias muestras obtenidas de la unidad de equipo de fabricación se obtienen de la superficie de uno o más recipientes de recogida, un recipiente de mezcla, un recipiente de reacción, un conducto de bajo flujo, un conducto de alto flujo y un dispositivo de administración.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración residual aceptable de HBPM es inferior a

aproximadamente 7, 8 microgramos por pulgada cuadrada de muestra.

11. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración residual aceptable de HBPM es inferior a aproximadamente 1, 0 microgramos por mililitro de muestra.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración residual aceptable de HBPM es inferior a aproximadamente 1, 8 microgramos por mililitro de muestra.