Método para la purificación por afinidad.

Un método para la purificación de una inmunoglobulina, donde:

a) el método comprende el paso de unir la inmunoglobulina a un material inmunoadsorbente que contiene almenos un agente de unión monoespecífico;

b) el agente de unión tiene afinidad por al menos dos epítopos de la inmunoglobulina que están espacialmenteseparados por al menos 30 angstrom; y,

c) el agente de unión monoespecífico es un dominio variable de un anticuerpo que se puede obtener de uncamélido que comprende sólo cadenas pesadas y que está naturalmente desprovisto de cadenas ligeras.

Método para la purificación por afinidad.

Campo de la invención La invención se refiere a un método para la purificación por afinidad y a un agente de unión para usar en ese proceso.

Antecedentes de la invención El uso de agentes de unión en la purificación por afinidad se conoce a partir de EP-A-434317. Este documento da a conocer que es posible inmovilizar agentes de unión específicos pequeños en un portador de fase sólida. Los agentes de unión están compuestos especialmente de los dominios VH y VL de las proteínas correspondientes, mantenidos juntos por su interacción natural. En la inmovilización estos agentes pequeños mantienen la afinidad por su ligando diana. Un ejemplo de la tecnología dada a conocer es la inmovilización de un Fv anti-lisozima en agarosa y su uso como un inmunoadsorbente. El inmunoadsorbente con el Fv anti-lisozima inmovilizado se empacó en una columna y en esta columna se cargó una mezcla de lisozima y otras proteínas. La columna se lavó para eliminar la proteína no unida y posteriormente se eluyó la proteína unida.

En este tipo de sistemas de inmunoafinidad la fuerza de unión, la especificidad y la capacidad del inmunoadsorbente son parámetros importantes.

La fuerza de unión y la especificidad se refieren a la unión entre el agente de unión y la diana. Especialmente el agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de éste, y la unión es altamente específica para la diana. Es deseable que la unión específica a la diana se maximice y la unión no específica se minimice. La unión con sólo una especificidad muy limitada está subyacente en los sistemas de purificación comerciales que se basan en la proteína A y la proteína L. Se sabe que éstos se unen a una amplia gama de moléculas de inmunoglobulina como las inmunoglobulinas de humano, ratón y rata.

La fuerza de la unión se debe equilibrar entre una buena unión de modo que la columna se cargue fácilmente con el material que es la diana y el material que no es la diana sea eluido antes de la elución de la diana, y el deseo de utilizar condiciones de elución suaves para evitar daños innecesarios a las moléculas diana. Las condiciones de elución muy rigurosas son indeseadas porque conducen a la desnaturalización, fragmentación u otros defectos del material diana. Además las condiciones suaves son beneficiosas para el material de la columna y aumentan la vida útil de la misma.

La capacidad del inmunoadsorbente indica la cantidad de material diana que puede ser unido por el material inmunoadsorbente en condiciones de unión. Una vez que se obtiene la capacidad máxima del material inmunoadsorbente, la carga adicional de la diana no se unirá sino que causará fugas del material diana en el eluyente. Esto resulta en una pérdida de rendimiento en la purificación de proteínas o requiere la inclusión de pasos del proceso adicionales (repetidos) .

En EP-A-434317 algunos de estos objetivos se abordan por ejemplo mediante el uso de dominios variables que tienen una afinidad reducida por el antígeno, llevando a la elución o desorción en condiciones más suaves. La unión no específica se reduce al reducir el tamaño del agente de unión hasta el mínimo requerido para la unión.

McNahon et al. (2000, Journal of Immunological methods 241:1-10) dan a conocer una IgM monoclonal múrida antiigG de cabra designado M11. Los autores describen que este anticuerpo monoclonal fue mono reactivo antes de la purificación, mientras que fue poli reactivo para muchas proteínas diferentes después de la purificación.

Lambin et al. (1993, Journal of Immunological methods 165:99-111) dan a conocer un método para purificar en gran medida una fracción de IgG4 que contiene predominante anticuerpos anti-polen con actividad de bloqueo en una columna de inmunoafinidad que contiene anticuerpos monoclonales humanos.

Bird et al. (1984, Journal of Immunological methods 71:97-105) dan a conocer el uso de anticuerpos monoclonales murinos específicos de la subclase humana (anti-IgG1; anti-IgG2; anti-IgG3; anti-IgG4 específicos) y restringidos a la subclase humana (anti-IgG2, 3 y 4, no IgG1; anti-IgG1, 2 y 4, no IgG3; anti-IgG1, 2 y 3, no IgG4) para estandarizar los procedimientos de inmunoafinidad para permitir el aislamiento de las preparaciones de subclases policlonales puras.

Monestier et al. (1989, Hybridoma 8 (6) :631-638) dan a conocer un método para la purificación de anticuerpos IgM murinos. Los autores dan a conocer la inmunización de ratas con un anticuerpo monoclonal murino IgM-kappa (TEPC 183) y tres semanas más tarde con un anticuerpo monoclonal murino IgM-lambda (MOPC 104E) , para generar anticuerpos monoclonales de rata para IgM murino. Se obtuvieron dos anticuerpos monoclonales de rata que se unen tanto a TEPC 183 como a MOPC 104E. Se observó que la unión es independiente de la cadena ligera.

WO 2004/041862 da a conocer polipéptidos anti-factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa) que contienen uno o más anticuerpos de dominio único dirigidos contra TNF-alfa. Además, se dio a conocer su uso en diagnóstico y tratamiento.

WO 2004/041867 da a conocer un método de administración de moléculas de proteína terapéuticas por vías de administración diferentes para evitar la inactivación. La solicitud da a conocer un constructo polipeptídico que contiene al menos un anticuerpo de dominio único dirigido contra la región constante de IgE.

Ewert et al. (2002, Biochemistr y 41:3628-3636) presentan propiedades biofísicas de dominios VHH de camélidos comparadas con las propiedades de dominios VH3 humanos. Los autores concluyen que los fragmentos VHH de camélidos se caracterizan por una estabilidad favorable y por su capacidad para fundirse reversiblemente sin agregación, permitiendo así que los fragmentos recuperen la afinidad de unión después de la renaturalización por calor.

Pérez et al. (2001, Biochemistr y 40:74-83) investigan la termoestabilidad de anticuerpos de cadena pesada de camélidos.

Muyldermans y Lauwereys (1999, Journal of Molecular Recognition 12:131-140) presentan un informe sobre anticuerpos de camélidos sólo de cadena pesada. Los autores discuten el anticuerpo de cadena única versus anticuerpos tradicionales e indican que esperan que los anticuerpos de dominio único de camélidos tengan utilidad en un número de aplicaciones biotecnológicas o médicas.

Van der Linden et al. (2000, Journal of Immunological methods 240:185-195) se plantean si las llamas son una fuente práctica de fragmentos VHH específicos para el antígeno y concluyen que los fragmentos VHH de anticuerpos específicos para el antígeno son fácilmente accesibles del anticuerpo de llama desarrollado contra la gonadotropina coriónica humana.

Aunque estas medidas hasta cierto punto pueden mejorar la capacidad, la especificidad y las características de afinidad del inmunoadsorbente, persiste el deseo de contar con materiales inmunoadsorbentes mejores.

Resumen de la invención Encontramos sorprendentemente que un material inmunoadsorbente que contiene un agente de unión específica, que es preferentemente un anticuerpo o un fragmento de éste, que se une al menos a dos epítopos de una diana, tiene la elevada afinidad deseada siendo posible aún realizar la elución en condiciones suaves. Cuando se utiliza como material para cromatografía en columna se encontró que da lugar a una alta capacidad de la columna. Por lo tanto la invención se refiere a un método para la purificación de una inmunoglobulina, donde:

a) el método comprende el paso de unir la inmunoglobulina a un material inmunoadsorbente que contiene al menos un agente de unión monoespecífico; b) el agente de unión tiene afinidad por al menos dos epítopos de la inmunoglobulina que están espacialmente separados por al menos 30 angstrom; y, c) el agente de unión monoespecífico es un dominio variable de un anticuerpo que se puede obtener de un camélido que comprende sólo cadenas pesadas y que está naturalmente desprovisto de cadenas ligeras.

En otro aspecto la invención se refiere a un método para purificar una molécula diana por inmunoafinidad, donde la molécula diana es una inmunoglobulina y el método comprende utilizar un material inmunoadsorbente que contiene al menos dos agentes de unión diferentes, donde los agentes de unión consisten en un agente de unión con afinidad de unión por un epítopo (uno) de la molécula diana y un agente de unión con afinidad de unión por un epítopo distinto (dos) de la molécula diana.

Descripción de la invención La molécula diana se define como una molécula que se debe unir a un agente de unión como un anticuerpo. Los ejemplos de moléculas diana son proteínas que requieren purificación,... [Seguir leyendo]

1. Un método para la purificación de una inmunoglobulina, donde:

a) el método comprende el paso de unir la inmunoglobulina a un material inmunoadsorbente que contiene al menos un agente de unión monoespecífico; b) el agente de unión tiene afinidad por al menos dos epítopos de la inmunoglobulina que están espacialmente separados por al menos 30 angstrom; y, c) el agente de unión monoespecífico es un dominio variable de un anticuerpo que se puede obtener de un camélido que comprende sólo cadenas pesadas y que está naturalmente desprovisto de cadenas ligeras.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la avidez del material inmunoadsorbente por la molécula de inmunoglobulina es al menos 50 veces superior que la menor afinidad de un agente de unión por un epítopo individual.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el material inmunoadsorbente contiene un primer agente de unión con afinidad de unión por un primer epítopo de la inmunoglobulina y un segundo agente de unión con afinidad de unión por un segundo epítopo de la inmunoglobulina y donde el primer y segundo epitopos son epítopos inmunológicamente diferentes.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde los al menos dos epítopos son al menos dos epítopos inmunológicamente idénticos que están repetidos en la inmunoglobulina.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el agente de unión contiene un dominio variable derivado de una inmunoglobulina que comprende un sitio de unión al antígeno completo para un epítopo de la inmunoglobulina en una cadena polipeptídica única y por medio de lo cual las secuencias de aminoácidos de la infraestructura del dominio variable tienen al menos 50% de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la infraestructura de cualquiera de las SEC. ID Nº: 1 a 33.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los al menos dos epítopos están fuera de la CDR de la inmunoglobulina.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde el al menos un epítopo está presente en la cadena ligera de una inmunoglobulina.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde los al menos dos epítopos son epítopos de una inmunoglobulina humana.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, donde los epítopos son epítopos de una cadena ligera de una inmunoglobulina humana del isotipo kappa o lambda.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9 , donde el agente de unión se selecciona del grupo de moléculas VHH que se unen a la cadena ligera kappa seleccionadas entre las SEC. ID Nº: 1 a 15, o un agente de unión que contiene un dominio variable derivado de una inmunoglobulina, que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) 1, 2 o 3 que tiene por lo menos 80, 85, 90, 95, 98% de identidad de aminoácidos con las CDR de las moléculas VHH de las SEC. ID Nº: 1 a 15.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9 , donde el agente de unión se selecciona del grupo de moléculas VHH que se unen a la cadena ligera kappa seleccionadas entre las SEC. ID Nº: 16 a 33, o un agente de unión que contiene un dominio variable derivado de una inmunoglobulina, que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) 1, 2 o 3 que tiene por lo menos 80, 85, 90, 95, 98% de identidad de aminoácidos con las CDR de las moléculas VHH de las SEC. ID Nº: 16 a 33.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que los al menos dos epítopos son al menos dos epítopos inmunológicamente distintos de un dominio Fc de la IgG humana.