Método para la elaboración de fragmentos de trombocitos aglutinables y su utilización.

Método para la elaboración de fragmentos de trombocitos aglutinables,

caracterizado porque en primer lugar setratan trombocitos nativos con ultrasonido, y se fijan a continuación.

Método para la elaboración de fragmentos de trombocitos aglutinables y su utilización La presente invención se encuentra en el área del diagnóstico, particularmente del diagnóstico de coagulación, y hace referencia a un método para la elaboración de fragmentos de trombocitos aglutinantes, y a su utilización en métodos de prueba de diagnóstico, que comprenden una reacción de aglutinación, como por ejemplo, en un método para la determinación de la actividad del VWF.

El factor de Willebrand (VWF) es una glicoproteína multimérica de elevado peso molecular, que presenta funciones importantes en el proceso de la hemostasia primaria. En el caso de un daño vascular, el VWF cumple con tres tareas esenciales: Dicho factor logra la adhesión de los trombocitos en el subendotelio, logra la agregación de los trombocitos entre sí, y de esta manera favorece la conformación de un trombo, y con el factor plasmático de coagulación sanguínea VIII (F VIII) conforma un complejo que protege el factor FVIII ante una descomposición anticipada. Mediante la trombina, FVIII se disocia del complejo de F VIII-VWF, y se activa para obtener F VIIIa, y de esta manera logra su actividad procoagulante que se indica frecuentemente también como F VIII:C.

El síndrome de Willebrand se genera debido a trastornos cualitativos o cuantitativos del VWF, y es una de las afecciones hemorrágicas hereditarias más frecuentes. Para el diagnóstico de un síndrome de Willebrand, se encuentran a disposición diferentes métodos de prueba, como por ejemplo, la determinación del tiempo de hemorragia (BT) , métodos cuantitativos para la determinación de la concentración de antígeno de VWF (VWF:Ag) , como por ejemplo, métodos de ELISA, así como métodos para la determinación de la actividad del VWF, como por ejemplo, la aglutinación de plaquetas inducida por la ristocetina (VWF:RCo) .

El método de la aglutinación de plaquetas inducida por la ristocetina, que se denomina también prueba del cofactor de ristocetina, detecta defectos funcionales de la proteína del VWF que no se detectan con los métodos cuantitativos para la determinación de la concentración del antígeno del VWF. Por consiguiente, la ejecución de una prueba del cofactor de ristocetina, para la determinación de la actividad del cofactor de ristocetina, resulta necesaria para el diagnóstico completo de un síndrome de Willebrand. Convencionalmente, la prueba del cofactor de ristocetina se realiza en tanto que se mezcla una muestra de plasma de un paciente, con trombocitos. Convencionalmente, para dicha prueba se utilizan trombocitos humanos fijados. Sin embargo, también se pueden utilizar trombocitos fisiológicamente activos, es decir, trombocitos nativos. Después de la adición de ristocetina, los trombocitos nativos realizan la agregación, o bien los trombocitos fijados realizan la aglutinación en relación con el VWF activo existente en la muestra. La reacción de la agregación, o bien de la aglutinación, se puede detectar de manera óptica, por ejemplo, mediante la medición del incremento de la transmisión, y de esta manera permite una cuantificación de la actividad del VWF:RCo. Sin embargo, la determinación de la reacción de la agregación, o bien de la aglutinación de todos los trombocitos, se encuentra ligada a algunas desventajas.

Por una parte, resulta una desventaja la necesidad de mezclar permanentemente la mezcla de reacción durante el registro óptico de los valores de medición. Es probable que el mezclado continuo resulte necesario para incrementar la frecuencia de colisión de los trombocitos y, de esta manera, para incrementar la velocidad de reacción. Sólo pocos equipos automatizados utilizados en los laboratorios modernos para el diagnóstico de hemostasia, disponen de dispositivos técnicos que permiten un mezclado continuo de esta clase, de la mezcla de reacción durante la medición. Por otra parte, la clásica prueba del cofactor de ristocetina, presenta una imprecisión relativamente elevada. Dado que la mayor parte de los equipos automatizados del área para el diagnóstico de hemostasia, se encuentran equipados con dispositivos ópticos que permiten sólo la medición de longitudes de onda en el rango visible, también se debería poder evaluar un método de prueba automatizado en dicho rango de longitud de onda. Durante la medición de la transmisión, debido a la aglutinación de trombocitos, sólo la formación de agregados de gran tamaño, genera un incremento de la transmisión en el rango visible de longitud de onda. Sin embargo, la formación de agregados de gran tamaño, que también resultan susceptibles a las interferencias mecánicas, no se puede detectar de manera precisa en las cubetas de prueba convencionales, relativamente reducidas, con ventanas de medición ópticas reducidas en correspondencia. Por consiguiente, las curvas de la reacción de la agregación de trombocitos, así como de la aglutinación de trombocitos, presentan convencionalmente una fluctuación considerable de los valores de medición.

Anteriormente se han desarrollado algunos métodos de prueba alternativos, que permiten una determinación precisa de la actividad del VWF:RCo. En algunos de dichos métodos, se utiliza el receptor de VWF GP1b o fragmentos de dicho receptor. De esta manera se han desarrollado, por ejemplo, los métodos de ELISA, que determinan el enlace del VWF inducido por la ristocetina, con el receptor GP1b. Un método de esta clase se describe, por ejemplo, en la bibliografía Federici, A. B. y otros (Haematologica 2004; 89 (1) , 77-85) , así como en la patente WO 01/02853 A2. Otro formato de prueba utiliza fases portadoras particulares, como por ejemplo, partículas de látex o liposomas (por ejemplo, Kitaguchi, T. y otros, Comunicación de investigación bioquímica y biofísica. 1999; 261 (3) :784-789) , a los cuales se acopla proteína GP1b. Las partículas asociadas al GP1b, se aglutinan en presencia de ristocetina y VWF activo.

En el método anteriormente mencionado, resulta desventajosa la elaboración de las fases sólidas asociadas al GP1b, que implica tiempos y costes elevados, que convencionalmente precede la depuración de la proteína de GP1b nativa o expresada de manera recombinada. Además, al menos, para la realización de algunos formatos de prueba, se debe disponer adicionalmente de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos de GP1b. En resumen, se trata de métodos complejos para los cuales se debe elaborar un serie de reactivos especiales.

El objeto de la presente invención consiste en proporcionar un agente que en lugar de los trombocitos nativos o fijados, se pueda utilizar en una prueba de aglutinación, y que permita una determinación precisa fotométrica de la reacción de aglutinación, en el caso de longitudes de onda en el rango visible.

Se ha descubierto que los fragmentos de trombocitos que se obtienen mediante un método, en el que en primer lugar se tratan con ultrasonido trombocitos nativos y a continuación se fijan, disponen de una capacidad de aglutinación que permite la utilización de los fragmentos de trombocitos en una prueba de aglutinación.

En el estado del arte, se conocen diferentes métodos para la elaboración de fragmentos de trombocitos. En la literatura, los fragmentos de trombocitos también se denominan microvesículas o micropartículas. En el caso de la elaboración mecánica de membranas de plaquetas, por ejemplo, mediante un tratamiento con ultrasonido, congelación/descongelación o cavitación con nitrógeno, se generan partículas de diferentes tamaños (Authi, K. S: Preparación de plaquetas humanas altamente purificadas, plasma y membranas intracelulares, mediante la utilización de electroforesis de flujo libre de alto voltaje, y métodos para el estudio de regulación de Ca2+. Capítulo 5 en Plaquetas - A Enfoque práctico, 1996, Hrsg. Steve P. Watson & Kalwant S. Authi, Prensa de la Universidad de Oxford, Reino Unido, y Lee, D.H. & Blajchman, M.A.: Sustitutos de plaquetas y nuevos métodos de preservación de plaquetas. Capítulo 60 en Plaquetas, 2002, Hrsg. Alan D. Michelson, Prensa Académica, Elsevier Science, Estados Unidos) . Mediante la composición heterogénea de esta clase de preparaciones, la utilización de esta clase de fragmentos de trombocitos en una prueba de aglutinación, resulta menos prometedora, dado que se requieren partículas de igual tamaño y con iguales propiedades de superficie. Además, los métodos conocidos implican frecuentemente tiempos y costes considerables, dado que dichos métodos comprenden una pluralidad de etapas de trabajo. Con frecuencia, los trombocitos se incuban con inhibidores para evitar una activación excesiva de los trombocitos, y para proteger dichos trombocitos ante la agresión de enzimas degradantes.

Un método para... [Seguir leyendo]

1. Método para la elaboración de fragmentos de trombocitos aglutinables, caracterizado porque en primer lugar se tratan trombocitos nativos con ultrasonido, y se fijan a continuación.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los trombocitos se tratan con ultrasonido en 5 presencia de un anticoagulante, y se fijan.

3. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque los trombocitos se tratan con ultrasonido en ausencia de inhibidores de la función de los trombocitos, y se fijan.

4. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque después del tratamiento con

ultrasonido, los trombocitos se fijan con agentes fijadores del grupo de formaldehído, paraformaldehído y 10 glutaraldehído.

5. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque después de la fijación se combina proteína del receptor GP1b con los fragmentos de trombocitos.

6. Utilización de fragmentos de trombocitos aglutinables que se pueden obtener de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, en un método para la determinación de la actividad del VWF de una muestra.

7. Método para la determinación de la actividad del VWF de una muestra, caracterizado porque la muestra se mezcla con fragmentos de trombocitos aglutinables que se pueden obtener de acuerdo con las reivindicaciones 1-5, y se determina la reacción de aglutinación de los fragmentos de trombocitos en la mezcla de reacción.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque a la mezcla de reacción se adiciona ristocetina.

9. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 y 8, caracterizado porque los fragmentos de trombocitos

se utilizan en forma de una suspensión, que contiene cloruro de sodio en una concentración menor a 5 g/L, preferentemente menor a 3 g/L.

10. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la mezcla de reacción no se mezcla de manera continua.

11. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque la reacción de aglutinación de

los fragmentos de trombocitos en la mezcla de reacción, se determina mediante la medición de la reducción de la transmisión.

Fig.1