Método para identificar proteínas y péptidos alergénicos.

Un método para identificar proteínas y péptidos alfaS1-, alfaS2-,

beta- o kappa- caseína de leche de vacaalergénicos que comprende los pasos de:

a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado del tejido de laglándula mamaria de una vaca lactante,

b) expresar al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína codificado por dichagenoteca de expresión,

c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- okappa- caseína a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de vaca,

d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína quemuestra capacidad de unión a IgE como se ha determinad en el paso c) con basófilos o células cebadas,e

e) identificar la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína como que esalergénico cuando dichos basófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto conal menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta- o kappa- caseína del paso d).

Método para identificar proteínas y péptidos alergénicos Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para identificar proteínas y péptidos alergénicos según se define en las reivindicaciones. Más específicamente, la presente invención proporciona un método para identificar proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína de leche de vaca alergénicos que comprende los pasos de a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de tejido de glándula mamaria de una vaca lactante, b) expresar al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína codificada por dicha genoteca de expresión, c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de vaca, d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína que muestra capacidad de unión a IgE como se determina en el paso c) con basófilos o células cebadas y e) identificar la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína como alergénico cuando dichos basófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína del paso d) .

Antecedentes de la invención Aproximadamente el 2-8% de los lactantes menores de 3 años y aproximadamente el 2% de la población adulta están afectados por hipersensibilidades alimentarias. Aproximadamente el 80% de las reacciones alérgicas en niños son el resultado de la hipersensibilidad a la leche de vaca (LV) , huevos de gallina y legumbres (por ejemplo, cacahuetes y soja) . En la población adulta, sin embargo, la alergia a frutas, cacahuetes y frutos secos de árbol representan las hipersensibilidades con la mayor prevalencia.

La leche de vaca está entre los primeros alimentos introducidos en la dieta de un lactante y por tanto es una de las causas más comunes de alergia alimentaria en niños pequeños. Aproximadamente el 2, 5% de los neonatos muestran reacciones adversas a la leche de vaca en el primer año de su vida.

Los síntomas de la alergia a la leche de vaca (ALV) son de tipo inmediato o retrasado y varían de reacciones moderadas a graves que afectan a la piel, el aparato respiratorio, el aparato digestivo y en el peor caso aparece como reacciones sistémicas potencialmente mortales (anafilaxia) . En contraste a las reacciones de tipo retrasado celulares, las reacciones inmediatas están causadas por la producción de anticuerpos inmunoglobulina E (IgE) en respuesta a antígenos de otro modo inocuos (hipersensibilidad de tipo I) . La interacción de los anticuerpos IgE con la molécula alergénica produce la activación específica de células efectoras (células cebadas, granulocitos basófilos) y una liberación posterior de mediadores inflamatorios como histamina, prostaglandina y leucotrieno que son responsables para las reacciones alérgicas de tipo inmediato.

La leche de vaca contiene más de 25 proteínas y se sabe que algunas de ellas son alergénicas. Mediante la acción de la quimosina (renina) o por acidificación de la leche a pH 4, 6 se obtienen dos fracciones: El veinte por ciento de las proteínas se encuentran en la fracción del suero y el 80% de las proteínas comprenden la fracción de caseína. Las moléculas alergénicas están contenidas en ambas fracciones y se consideran alergenos principales o secundarios dependiendo de la incidencia de las respuestas alérgicas documentadas en la población ALV.

Los alergenos principales presentes en la leche de vaca son al alfa-lactoalbúmina, beta-lactoglobulina, alfaS1caseína, beta-caseína y kappa-caseína. Los alergenos secundarios presentes en la leche de vaca son alfaS2caseína, lactoferrina, seroalbúmina bovina e inmunoglobulina.

Alfa-lactoalbúmina (Bos d 4) , beta-lactoglobulina (Bos d 5) , inmunoglobulinas (Bos d 7) , BSA y lactoferrina son los componentes reactivos con IgE bien conocidos en suero. AlfaS1-caseína, alfaS2-caseína, beta-caseína y kappacaseína con los alergenos potentes en la fracción de caseína (Bos d 8) (Wal, 2004) .

En la fracción de suero la beta-lactoglobulina (BLG) y la alfa-lactoalbúmina (ALA) se consideran como los alergenos principales. La beta-lactoglobulina es una proteína globular y muy estable que pertenece a las lipocalinas, una superfamilia de proteínas, que se une a ligandos hidrofóbicos. Otros alergenos como los alergenos principales de los perros Can f 1 y Can f 2 y alergenos de otros animales con piel (caballo, gato y cobaya) también pertenecen a esta superfamilia de proteínas. La beta-lactoglobulina se produce de forma natural en una forma dimérica con un peso molecular de 36 kDa. Hay dos isoformas principales de beta-lactoglobulina, las variantes genéticas A (BLGA) y B (BLGB) , que se diferencian en los aminoácidos 64 y 118 (ácido aspártico y valina en BLGA, glicina y alanina en BLGB) . La estabilidad y el hecho de la beta-lactoglobulina pertenezca a la familia de las lipocalinas puede explicar el alto potencial alergénico de esta molécula.

La alfa-lactoalbúmina es un monómero ácido que se une a Ca2+ de 14 kDa estabilizado por cuatro puentes disulfuro. Es un componente regulador en el sistema galactosiltransferasa que sintetiza lactosa. El análisis de secuencia mostró alta homología de secuencia de aminoácidos a la alfa-lactoalbúmina humana (hALA) y lisozima de huevo de gallina; un alergeno principal del huevo de gallina. La alergenicidad de la alfa-lactoalbúmina se puede explicar por su estabilidad.

En suspensión las proteínas de la fracción de caseína forman agregados ordenados (micelas) con una proporción constante de moléculas individuales: alfaS1 y alfaS2-caseína el 37% de cada una, beta-y kappa-caseína el 13% cada una. Las cuatro moléculas de caseína tienen poco homología en la estructura primaria, tienen diferentes propiedades funcionales, pero todas son proteínas fosforiladas con estructuras terciarias muy hidratadas, reomórficas que pueden ser degradadas fácilmente por algunas proteasas. Esta sensibilidad a la digestión proteolítica es una característica bastante inusual para un alergeno importante. Las caseínas de leche de vaca comparten homologías de secuencia de aminoácidos de hasta el 90% con caseínas de otros mamíferos, como cabra y oveja. Esta homología de secuencia podría ser la razón para la reactividad cruzada frecuentemente observada entre la leche de vaca y la leche de otros animales.

La presente invención aborda la necesidad de proporcionar métodos que permitan identificar proteínas y péptidos alergénicos presentes en una fuente biológica.

Compendio de la invención La presente invención se define mediante las reivindicaciones. Según esto, la presente invención se refiere a un método para identificar proteínas y/o péptidos alergénicos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína de leche de vaca que comprende los pasos de a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado de tejido de glándula mamaria de una vaca lactante, b) expresar al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína codificada por dicha genoteca de expresión, c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de vaca, d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína que muestra capacidad de unión a IgE como se determina en el paso c) con basófilos o células cebadas y e) identificar la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína como alergénico cuando dichos basófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína del paso d) .

Según una forma de realización preferida el método de la invención comprende además un paso de determinar la secuencia de aminoácidos de al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína identificado en el paso e) .

Según otra forma de realización del método de la invención, la presencia de una proteína y/o péptido alfaS1-, alfaS2, beta o kappa-caseína se determina por espectrometría de masas.

Según una forma de realización preferida adicional del método de la invención, las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan antes de la espectrometría de masas.

Según una forma de realización más preferida del método de la invención, las proteínas y/o péptidos... [Seguir leyendo]

1. Un método para identificar proteínas y péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína de leche de vaca alergénicos que comprende los pasos de:

a) proporcionar al menos una genoteca de expresión que comprende ADN o ADNc derivado del tejido de la glándula mamaria de una vaca lactante,

b) expresar al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína codificado por dicha genoteca de expresión,

c) determinar la capacidad de unión de dicha al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína a IgE de al menos un suero de un individuo que es sensible a la leche de vaca,

d) poner en contacto la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína que muestra capacidad de unión a IgE como se ha determinad en el paso c) con basófilos o células cebadas, e e) identificar la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína como que es alergénico cuando dichos basófilos o células cebadas liberan al menos un mediador tras el contacto con al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína del paso d) .

2. El método según la reivindicación 1, en donde el método comprende además un paso de determinar la secuencia de aminoácidos de la al menos una proteína o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína identificada en el paso e) .

3. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de al menos una proteína y/o péptido alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína se determina por espectrometría de masas.

4. El método de la reivindicación 3, en donde las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan antes la espectrometría de masas.

5. El método de la reivindicación 4, en donde las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan por un método electroforético.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el método electroforético es electroforesis bidimensional.

7. El método de la reivindicación 4, en donde las proteínas y/o péptidos alfaS1-, alfaS2-, beta-o kappa-caseína presentes en la muestra se aíslan por cromatografía líquida de alta resolución.

Componente de la leche Nombre MW (kDa)

proteínas purificadas

α-caseína β-caseína κ-caseína α-lactoalbúmina β-lactoglobulina, variante A β-lactoglobulina, variante B lactoferrina seroalbúmina bovina seroalbúmina de oveja α-lactoalbúmina humana fracciones de leche Bos d 8 alfa Bos d 8 beta Bos d 8 kappa Bos d 4 Bos d 5 A Bos d 5 B Bos d lactoferrina Bos d 6 Ovi SSA Hom s lactoalbúmina 25, 5 (αS1) 26 (αS2) 24, 0 19, 0 14, 2 18, 3 18, 3 80 66, 3 24, 3 16, 2

caseína de vaca caseína de oveja caseína de cabra proteínas recombinantes Bos d 8 Ovi a caseína Cap b caseína 19-26 24, 3 24, 3

ταS1-caseína ταS2-caseína τβ-caseína τκ-caseína τα-lactoalbúmina τβ-lactoglobulina fragmentos recombinantes Bos d 8 alfaS1 Bos d 8 alfaS2 Bos d 8 beta Bos d 8 kappa Bos d 4 Bos d 5 B 23, 9 25, 3 24, 3 19, 9 19, 2 15, 1

fragmento 1 de BSA, AA 1-190 fragmento 2 de BSA, A.

20. 389 fragmento 3 de BSA, A.

39. 590 péptidos de α-caseína 23, 9 22, 6 23, 4

Cas1, AA 1-31 Cas2, A.

3. 64 Cas3, A.

6. 100 Cas4, A.

10. 133 Cas5, AA134-167 Cas6, A.

16. 199 péptidos de α-lactoalbúmina 3, 8 3, 8 4, 3 3, 9 4, 2 3, 6

Lac1, AA 1-19 Lac2, AA 15-34 Lac3, A.

3. 49 Lac4, A.

4. 64 Lac5, A.

6. 79 Lac6, A.

7. 94 Lac7, A.

9. 109 Lac8, A.

10. 123 muestras de leche entera 2, 3 2, 2 2, 2 2, 4 2, 3 2, 3 2, 3 2, 2

leche de vaca leche de oveja leche de cabra leche de yegua leche humana Bos d Ovi a Cap h Equ c Hom s

Fig. 4a

Línea coincidente con la Figura 6b

Línea coincidente con la figura 6a

Función Preparación Referencia

transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio subunidad reguladora de lactosa sintasa lipocalina, se une a retinol lipocalina, se une a retinol transferrina, proteínas transportadoras de unión a hierro regulación de la presión osmótica de la sangre regulación de la presión osmótica de la sangre subunidad reguladora de lactosa sintasa natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada natural purificada Stewart A.F. et al., 1984, X00564 Stewart A.F. et al., 1987, M16644 Boev A.A. et al., 1987, M16645 Alexander L.J. et al., 1988, X14907 Vilotte J. L., 1987, 18780 Oliviera K.M. et al, 2001, I065 A Brauntzer G. et al., 1973, X14712 Pierce A. et al., 1991 X57084 sin publicar, M73993 Brown W.M. et al., 1989 CAA34903 Hall L. et al., 1982, J00270

transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio natural purificada natural purificada natural purificada Stewart A.F. et al., 1984, X00564 Stewart A.F. et al., 1987, M16644 Boev A.A. et al., 1987, M16645 Alexander L.J. et al., 1988, X14907 Boev A.A. et al., 1987, M16645 Alexander L.J. et al., 1988, X14907

transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio transporte de fosfato de calcio subunidad reguladora de lactosa sintasa lipocalina, se une a retinol recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His

recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His recombinante, con etiqueta His

sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado

sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado sintetizado

Fig. 4b

Resultados de la búsqueda Mascot Vista de proteína Coincidencia con: CASB_BOVINA puntuación: 144 Precursor de beta-caseína -Bos taurus (Bovino)

Encontrada en la búsqueda de D:\Data\milk 0.3171.07mgf Masa nominal (Mr) : 25149; Valor de pI calculado: 5, 26 Búsqueda en BLAST NCBI de CASB_BOVIN contra nr Cadena de secuencia sin formular para pegar en otras aplicaciones Taxonomía: Bos taurus Modificaciones fijas: Carboximetilo (C) Modificaciones variables: Oxidación (M) Sin especificidad de corte enzimático Cobertura de secuencia 11%

Fig. 6