Método para controlar reacciones de biooxidación.

Un método para controlar una reacción de biooxidación que comprende las etapas de:

(1) añadir de formaindependiente un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste de un ácido carboxílico o un alcano y uncosustrato en tasas predeterminadas a una mezcla de reacción de biooxidación que cuanta con un biocatalizadorque es Candida Tropicalis H5343, (2) la medición de la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de desprendimiento dedióxido de carbono de la mezcla de reacción, (3) la determinación de las tasas instantáneas de consumo de sustratoy cosustrato por medio de la resolución de ecuaciones simultáneas en relación con la tasa de desprendimiento dedióxido de carbono y la tasa de consumo de oxígeno con respecto a la estequiometría de oxidación del sustrato, laestequiometría de combustión del cosustrato, y, opcionalmente, la estequiometría de formación de la biomasa; (4)ajustar simultáneamente las tasas de adición de sustrato y cosustrato con respecto a las tasas de oxidación delsustrato y de consumo del cosustrato con el fin de maximizar la tasa de formación de producto al mismo tiempo quese reduce al mínimo la tasa de uso del cosustrato.

Método para controlar reacciones de biooxidación Antecedentes de la invención Enzimas y microorganismos, a través de la reducción directa del oxígeno molecular, catalizan naturalmente gran variedad de reacciones de oxidación. Estas reacciones altamente irreversibles pueden ser consideradas como bastante violentas desde una perspectiva bioquímico liberando gran cantidad de energía libre de reacción en forma de calor. El mecanismo fundamental por medio del cual ocurren biooxidaciones muy diversas de sustratos orgánicos puede considerarse generalmente, en primer lugar, como la activación de oxígeno molecular para formar una especie de oxígeno altamente reactivo. Esto es seguido por un desplazamiento de los electrones desde el sustrato hasta la especie activada de oxígeno que resulta en la oxidación neta del sustrato. Los átomos originales de oxígeno del oxígeno molecular pueden o no ser incorporados en el sustrato orgánico para elaborar el producto de oxidación deseado. La reacción puede ser catalizada por medio de una sola enzima o a través de la acción coordinada de múltiples enzimas. Muchas enzimas y sistemas enzimáticos que contienen, citocromos, monooxigenasas, dioxigenasas, desaturasas y las oxidasas, son capaces de aprovechar el poder reactivo del oxígeno molecular para la oxidación de sustratos orgánicos con una selectividad y especificidad sin precedentes por medio de síntesis química clásica.

Existe un gran incentivo para explotar estas reacciones mediante su aplicación a sustratos químicos ordinarios por medio de la adición de una o más funciones químicas en posiciones particularmente deseables en la molécula sustrato. Debido a la selectividad y especificidad de ciertos biocatalizadores, se pueden eliminar muchas reacciones químicas y etapas de purificación con su producto concomitante y pérdidas de sustrato. Alternativamente, estas reacciones pueden ayudar a la degradación de los productos químicos no deseados, nuevamente mediante la adición de una función a la molécula haciéndola más fácil de secuestrar para su eliminación o degradación adicional en etapas de transformación subsiguientes.

Existen muchas barreras que superar para operar con éxito estas reacciones con fines comerciales. La generación de especies de oxígeno altamente reactivas es, en términos metabólicos, una reacción violenta. Estos compuestos intermedios reactivos pueden dañar o degradar el biocatalizador, destruir la actividad enzimática en la búsqueda por lograr la transformación deseada, o una reacción no selectiva con el sustrato. Como ha señalado Str y er en su texto "Bioquímica", El peligro acecha en la reducción del oxígeno. Los organismos que utilizan oxígeno molecular poseen enzimas y sistemas enzimáticos para depurar los radicales de oxígeno de naturaleza renegada. En las reacciones de biooxidación rápida que ocurren en fermentaciones industriales, tales radicales puede sobrepasar los niveles de origen natural de estos sistemas depuradores. Como resultado, en las células viables que involucran reacciones de biooxidación, es común observar un rápido decaimiento en la viabilidad celular y la recuperación de las células viables (Dixon, B., "Viable but Nonculturable", ASM News, 64, páginas 372 - 373, 1998) .

Amplios rangos de las moléculas orgánicas son sustratos potenciales para biooxidación, sin limitación por la preferencia del sustrato natural de la ruta de oxidación, para elaborar muchos productos de oxidación. Ciertas características del sustrato pueden dictar cómo se combinará con el catalizador de oxidación para efectuar la oxidación. El sustrato puede 1) ser tóxico, desactivar el catalizador,

2) ser volátil y susceptible de perderse en la salida de gases del fermentador,

3) reprimir su propia oxidación,

4) inducir o causar reacciones secundarias no deseadas,

5) ser costoso; depositar grandes cantidades de sustrato en el recipiente añade riesgo, puede fallar el lote por causa de una falla del equipo o contaminación,

6) generar reacciones de oxidación no selectivas u otras reacciones,

7) causan problemas en la recuperación o purificación del producto,

8) pueden formar mezclas explosivas con el aire.

Por estas razones, a menudo es deseable añadir el sustrato de manera continua o en incrementos medidos en forma discreta durante la fermentación en un modo de operación alimentado por lotes para minimizar la acumulación de sustrato.

A pesar de la gran cantidad de energía libre termodinámicamente disponible a partir de muchas reacciones de biooxidación, estas reacciones tienden a ser altamente irreversibles liberando mucha de la energía libre de reacción en forma de calor en lugar de como formas útiles para el trabajo metabólico. Esto es debido a la entrada de energía metabólica inicial necesaria para crear la especie reducida de oxígeno a partir del oxígeno molecular. Para generar esta energía metabólica necesaria dirigiendo la reacción de biooxidación deseada y manteniendo el biocatalizador, se suministra un segundo sustrato al sistema de reacción. Este segundo sustrato se denomina frecuentemente el cosustrato y puede ser seleccionado entre cualquiera entre una cantidad de compuestos fermentables de uso común para la fermentación, por ejemplo, sacáridos, ácidos orgánicos, alcoholes o hidrocarburos. Por razones similares a las del sustrato de biooxidación, puede ser deseable añadir el cosustrato de manera continua o en incrementos medidos en forma discreta para minimizar la acumulación del cosustrato.

Se conoce en el arte algún control de la concentración de sustrato. Por ejemplo, la concentración del sustrato ML236B Na fue controlada en una reacción de hidroxilación mediada por citocromo P450 para elaborar pravastatina. Un módulo de filtración de flujo cruzado y una bomba peristáltica generaron un filtrado. Este filtrado fue periódicamente analizado por medio de HPLC automatizado para obtener una medición en tiempo real de la concentración de ML236B Na en la mezcla de reacción acuosa. El sistema de flujo cruzado funcionó bien con el sustrato soluble aparentemente porque la cepa no formó precipitados grandes y no había presentes sustancias oleosas en la mezcla de reacción. Sin embargo, no se aplicó control a la alimentación del cosustrato de glucosa al 50% que se mantuvo constante durante el transcurso de la reacción.

Por lo tanto, existe la necesidad por métodos para controlar simultáneamente la adición de múltiples corrientes de alimentación en el campo de las biooxidaciones. Los sustratos, cosustratos, y productos de biooxidación son frecuentemente moléculas complejas que pueden ser muy poco solubles en sistemas acuosos que, junto con el biocatalizador, constituyen una matriz compleja de reacción. Aunque se pueden aplicar una variedad de técnicas de análisis fuera de línea para el análisis de productos, sustratos y cosustratos, tales métodos tienden a ser laboriosos y de poco valor para control en tiempo real de la alimentación de nutrientes en estas reacciones alimentadas por lotes. Por lo tanto, uno se siente motivado a buscar métodos rápidos computarizados para controlar simultáneamente la alimentación de sustrato y de cosustrato a las reacciones de biooxidación.

En contraste, la fase gaseosa es una matriz relativamente simple para la cual se encuentran disponibles una variedad de instrumentos para realizar las mediciones de la composición de la fase gaseosa. Cuando se combina con una medición del flujo de gas hacia y desde la reacción de biooxidación, los balances de toda la fase gaseosa y sus componentes proporcionan una medición en tiempo real de la tasa de evolución de dióxido de carbono (CER) y la tasa de consumo de oxígeno (OUR) .

El concepto de control de la alimentación de nutrientes en fermentaciones alimentadas por lotes mediante balances de los componentes del gas es conocido en la técnica. En particular, se han utilizado las mediciones del balance de componentes del gas para calcular y controlar la concentración del sustrato o para controlar la tasa de crecimiento específico.

Carragher et al: divulga en el artículo "The use of oxygen uptake rate measurements to control the supply of toxic sustrato: Toluene hydroxylation by Pseudomonas putida UV4" en Enzyme and Microbial Technology, vol. 28, no. 2 - 3, 1 de febrero de 2001, páginas 138 - 188 un proceso para controlar la hidroxilación de tolueno por medio de Pseudomonas putida UV4. El tolueno que es un sustrato tóxico es alimentado por medio de un sistema de control automático en respuesta a un consumo alto de oxígeno y la tasa de evolución de CO2. Se alimenta el cosustrato etanol en respuesta a la concentración de etanol medida en ambos donde... [Seguir leyendo]

1. Un método para controlar una reacción de biooxidación que comprende las etapas de: (1) añadir de forma independiente un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste de un ácido carboxílico o un alcano y un cosustrato en tasas predeterminadas a una mezcla de reacción de biooxidación que cuanta con un biocatalizador que es Candida Tropicalis H5343, (2) la medición de la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de desprendimiento de dióxido de carbono de la mezcla de reacción, (3) la determinación de las tasas instantáneas de consumo de sustrato y cosustrato por medio de la resolución de ecuaciones simultáneas en relación con la tasa de desprendimiento de dióxido de carbono y la tasa de consumo de oxígeno con respecto a la estequiometría de oxidación del sustrato, la estequiometría de combustión del cosustrato, y, opcionalmente, la estequiometría de formación de la biomasa; (4) ajustar simultáneamente las tasas de adición de sustrato y cosustrato con respecto a las tasas de oxidación del sustrato y de consumo del cosustrato con el fin de maximizar la tasa de formación de producto al mismo tiempo que se reduce al mínimo la tasa de uso del cosustrato.

2. El método de la reivindicación 1 en donde el ácido carboxílico es ácido oleico.

3. El método de la reivindicación 1 en donde el cosustrato es glucosa.

4. Un método para elaborar un ácido a, º-dicarboxílico que comprende las etapas de: (1) añadir de forma independiente un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste de un alcano, un alqueno, un alcohol, un aldehído, un ácido carboxílico o un derivado de los mismos y un cosustrato a tasas predeterminadas a una mezcla de reacción de biooxidación que se compone de un biocatalizador que es Candida Tropicalis H5343, (2) la medición de la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de desprendimiento de dióxido de carbono de la mezcla de reacción, (3) la determinación de las tasas instantáneas de consumo de sustrato y cosustrato por medio de la resolución de ecuaciones simultáneas en relación con la tasa de desprendimiento de dióxido de carbono y la tasa de consumo de oxígeno con respecto a la estequiometría de oxidación del sustrato, la estequiometría de combustión del cosustrato, y, opcionalmente, la estequiometría de formación de la biomasa; (4) ajustar simultáneamente las tasas de adición de sustrato y cosustrato con respecto a las tasas de oxidación del sustrato y de consumo del cosustrato con el fin de maximizar la tasa de formación del ácido a, º-dicarboxílico al mismo tiempo que se reduce al mínimo la tasa de uso del cosustrato.

5. El método de la reivindicación 4 en donde el sustrato es un alcano.

6. El método de la reivindicación 4 en donde el sustrato es un ácido carboxílico.

7. El método de la reivindicación 6 en donde el ácido carboxílico es ácido oleico.

8. El método de la reivindicación 4 en donde el cosustrato es glucosa.

9. Un método para elaborar un ácido 9-octadecenodioico que comprende las etapas de: (1) añadir de forma independiente ácido oleico y glucosa a tasas predeterminadas a una mezcla de reacción de biooxidación que se compone de Candida Tropicalis H5343; (2) la medición de la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de desprendimiento de dióxido de carbono de la mezcla de reacción; (3) la determinación de las tasas instantáneas de consumo de ácido oleico y glucosa por medio de la resolución de ecuaciones simultáneas en relación con la tasa de desprendimiento de dióxido de carbono y la tasa de consumo de oxígeno con respecto a la estequiometría de oxidación del ácido oleico, la estequiometría de combustión de la glucosa, y, opcionalmente, la estequiometría de formación de la biomasa; (4) ajustar simultáneamente las tasas de adición de ácido oleico y de glucosa con respecto a las tasas de oxidación del ácido oleico y de consumo de glucosa con el fin de maximizar la tasa de formación del ácido 9-octadecenodioico al mismo tiempo que se reduce al mínimo la tasa de uso de glucosa.

R = cualquier constituyente que tenga un grupo –CH3 oxidable = el extremo terminal de un alcano o alqueno con un total d.

9. 20 carbonos

= el extremo del ácido carboxílico de ácido graso saturado o insaturado con un total d.

9. 20 carbonos