Método de diagnóstico de cánceres de pulmón utilizando perfiles de expresión genética en células mononucleares de sangre periférica.

Una composición para evaluar la existencia de un cáncer de pulmón en un sujeto mamífero,

consistiendo dichacomposición en: tres o más polinucleótidos u oligonucleóticos, en la que cada polinucleótido u oligonucleótidohibridiza un gen, fragmento de gen o transcripción de gen o producto de expresión diferente a partir de célulasmononucleares de sangre periférica (PBMC) o de sangre total del mamífero, y

en la que cada uno de dichos gen, fragmento de gen, transcripción de gen o producto de expresión se elige a partirde los genes 1-29 de la Tabla V.

Método de diagnóstico de cánceres de pulmón utilizando perfiles de expresión genética en células mononucleares de sangre periférica Antecedentes de la invención El cáncer de pulmón es la causa de mortalidad por cáncer más común en todo el mundo. En los Estados Unidos, el cáncer de pulmón es el segundo cáncer más común tanto en hombres como en mujeres, y asciende a más de 174.000 nuevos casos cada año y más de 162.000 muertes por cáncer. De hecho, el cáncer de pulmón ocasiona más muertes al año que los de pecho, próstata y colo-rectales juntos2.

La alta mortalidad (80-85% en cinco años) , que no ha mostrado ninguna, o muy poca, mejora en los últimos 30 años, pone de relieve el hecho de que se necesitan herramientas nuevas y eficaces que faciliten un pronto diagnóstico con anterioridad a la metástasis en nodos locales o por más allá del pulmón.

Las poblaciones de alto riesgo incluyen los fumadores, los antiguos fumadores, y los individuos con marcadores asociados a predisposiciones genéticas91-93. Puesto que la extracción quirúrgica de tumores en fase temprana sigue siendo el tratamiento más eficaz para el cáncer de pulmón, se ha desarrollado un gran interés en proteger los pacientes de alto riesgo con CT espiral de baja dosis (LDCT) 12, 14, 11, 94. Esta estrategia identifica nódulos pulmonares no calcificados en aproximadamente un 30-70% de individuos de alto riesgo, pero solamente una pequeña proporción de nódulos detectados son finalmente diagnosticados como cánceres pulmonares (0, 4 a 2, 7%) 16, 95, 96 . Normalmente, la única manera de distinguir sujetos con nódulos de pulmón de etiología benigna de los sujetos con nódulos malignos es una biopsia invasiva, cirugía u observación prolongada con exploración repetida. Incluso usando los mejores algoritmos clínicos, el 20-55% de los pacientes seleccionados para someterse a biopsia quirúrgica de pulmón para nódulos de pulmón indeterminados, se encuentra que tienen una enfermedad benigna15 y aquellos que no se someten a biopsia o resección inmediata requieren estudios secuenciales de obtención de imágenes. El uso de CT serie de este grupo de pacientes corre el riesgo de retrasar la potencial terapia curable, junto con los costes de repetición de exploraciones, las dosis de radiación nada despreciables, y la ansiedad del paciente.

Idealmente, una prueba diagnóstica podría ser fácilmente accesible, barata, demostrar una alta sensibilidad y especificidad, y dar como resultado consecuencias mejoradas del paciente (médica y financieramente) . Se están realizando esfuerzos por desarrollar diagnósticos no invasivos usando saliva, sangre o suero y analizando sustancias de las células tumorales, ADN7, 8 de tumor metilado, ARN10 mensajero expresado de polimorfismo de nucleótido simple (SNPs) 9 o proteínas 11. Esta amplia batería de pruebas moleculares con potencial utilidad para un pronto diagnóstico del cáncer de pulmón, ha sido ya discutida en la literatura. Aunque cada una de estas alternativas tiene sus propios méritos, ninguna de ellas ha superado aún la fase exploratoria en cuanto al esfuerzo por detectar pacientes con cáncer de pulmón en fase temprana, incluso en grupos de riesgo, o pacientes que tienen un diagnóstico preliminar basado en factores radiológicos u otros factores12 clínicos. Una simple prueba sanguínea, un evento rutinario asociado a visitas regulares a ambulatorios, sería una prueba diagnóstica ideal.

Un método establecido para conseguir el objetivo de diagnóstico genético ha consistido en el uso de signaturas de micro-matriz procedentes de tejido tumoral20. Esta alternativa ha sido probada y validada por numerosos investigadores89. Un número creciente de estudios ha mostrado que se pueden usar perfiles de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para diagnosticar y clasificar enfermedades sistémicas, incluyendo el cáncer, y para monitorizar la respuesta terapéutica21. La validez de usar perfiles de PBMC en pacientes con cáncer ha sido informada previamente en el uso de micro-matrices para comparar PBMC de pacientes con carcinoma de célula renal en fase tardía en comparación con controles normales20, 42. Una publicación 43 más reciente describe el desarrollo de un clasificador de 37 genes para la detección temprana de un cáncer de pecho a partir de muestras de sangre periférica con un 82% de precisión. Otro estudio identificó perfiles de expresión genética en la PBMC de pacientes de cáncer colo-rectal que podían estar co-relacionados con respuesta a terapia44. Algunos de los presentes inventores sugirieron22 con anterioridad que las quimiocinas y las citocinas liberadas por células malignas podrían imponer una signatura específica de tumor sobre células inmunes de pacientes con cánceres no hematopoyéticos. Se han generado ahora perfiles de expresión genética a partir de PBMC que identifican signaturas asociadas a una diversidad de cánceres, incluyendo el melanoma metastático23, de pecho24, renal25, 26 y el cáncer de vejiga27. La mayor parte de estos estudios fueron enfocados sobre cánceres en fase posterior o sobre respuesta a terapia y se utilizaron grupos de control sanos más jóvenes a efectos de comparación.

Mientras que el efecto de la enfermedad pulmonar de obstrucción crónica (COPD) sobre la expresión genética de PBMC permanece relativamente sin estudiar hasta la fecha, existen algunos informes limitados acerca del efecto del humo del cigarrillo33. La exposición de linfocitos de sangre periférica (PBL) ex vivo al humo del cigarrillo indujo muchos cambios en la expresión genética34. Los cambios pudieron ser detectados en el transcriptosoma de neutrófilos de la sangre en pacientes de COPD frente a los normales35. Un estudio distinguió “entre 85 individuos expuestos y no expuestos al humo del tabaco en base a expresión de mARN en leucocitos periféricos”36. No se

encuentra aparentemente ningún dato disponible en cuanto a cambios similares en la sangre que pueda estar presente en antiguos fumadores. Se ha comparado37 la expresión genética en los epitelios de las vías respiratorias de fumadores, ex-fumadores y no fumadores. Aunque muchas manifestaciones clínicas de fumar se volvieron rápidamente normales después de dejar de fumar, existió un subconjunto de genes cuya expresión permaneció alterada. La hipermetilación38 genética diferencial y la producción 33 de citocina macrófaga desregulada, han sido vinculadas al humo del cigarrillo. Existen informes de signatura o perfil de expresión genética útil en el diagnóstico del cáncer de pulmón111.

A pesar de los recientes avances, el reto del tratamiento del cáncer sigue siendo unos regímenes de tratamiento específico objetivo de tipos de tumor patológicamente distintos, y finalmente, personalizar el tratamiento del tumor con el fin de maximizar el resultado. Por ello, existe una necesidad de pruebas que proporcionen simultáneamente información predictiva acerca de respuestas de los pacientes a la diversidad de opciones de tratamiento. En particular, una vez que se diagnostica un cáncer, existe una gran necesidad de métodos que permitan al médico predecir el curso esperado de la enfermedad, incluyendo la probabilidad de recurrencia del cáncer, la supervivencia a largo plazo del paciente, y similares, y seleccionar la opción de tratamiento adecuadamente. También sigue existiendo una necesidad en el estado de la técnica de una prueba menos invasiva que pudiera determinar de manera más precisa el riesgo de enfermedad maligna en pacientes con nódulos pulmonares y que pudiera reducir la cirugía, las biopsias, las exploraciones PET, y/o las exploraciones CT repetidas, que sean innecesarias.

Sumario de la invención Según un aspecto, se proporciona una composición para evaluar la existencia de un cáncer de pulmón en un mamífero. Esta composición consiste en tres o más polinucleótidos u oligonucleótidos, donde cada polinucleótido u oligonucleótido se hibridiza en un gen, fragmento de gen, transcripción o producto de expresión de gen diferente a partir de células mononucleares de sangre periférica de un mamífero (PMBC) . El gen, fragmento de gen, transcripción o producto de expresión de gen se selecciona entre los primeros 29 genes de la Tabla V (mencionados en lo que sigue como “clasificador de 29 genes”, o en un subconjunto de los mismos. Esta realización es particularmente útil para el diagnóstico de un cáncer de pulmón, tal como un NSCLC, y para distinguir entre sujetos con cáncer y sujetos con una enfermedad de pulmón que no sea cáncer.

Según otro aspecto más, la invención se refiere al uso de dicha composición para el diagnóstico in vitro de la existencia de un cáncer de pulmón en un sujeto mamífero, que comprende... [Seguir leyendo]

1. Una composición para evaluar la existencia de un cáncer de pulmón en un sujeto mamífero, consistiendo dicha composición en: tres o más polinucleótidos u oligonucleóticos, en la que cada polinucleótido u oligonucleótido hibridiza un gen, fragmento de gen o transcripción de gen o producto de expresión diferente a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de sangre total del mamífero, y

en la que cada uno de dichos gen, fragmento de gen, transcripción de gen o producto de expresión se elige a partir de los genes 1-29 de la Tabla V.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, la cual es un reactivo que comprende un substrato sobre el que se inmovilizan dichos polinucleótidos u oligonucleótidos.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una micro-matriz, una tarjeta micro-fluídica, un chip o una cámara.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, la cual es un kit que contiene dichos tres o más polinucleótidos u oligonucleótidos, en la que dichos polinucleótidos u oligonucleótidos son cada parte de un conjunto de imprimador-sonda, y dicho kit comprende tanto imprimadores como sondas, en la que conjunto de imprimadorsonda citado amplifica un gen, fragmento de gen o producto de expresión de gen diferente.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que uno o más polinucleótidos u oligonucleótidos está (n) asociado (s) a una etiqueta detectable.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos genes seleccionados comprenden 4 o más genes.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos genes seleccionados comprenden 15 o más genes.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos genes seleccionados comprenden 20 a 29 genes.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dichos genes seleccionados consisten en los genes 1 a 29 de la Tabla V.

10. Uso de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el diagnóstico in vitro de la existencia de un cáncer de pulmón, que comprende identificar cambios en la expresión de tres o más genes procedentes de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o de la sangre total de un sujeto, en el que los cambios de expresión de los genes del sujeto con respecto a una referencia están correlacionados con un diagnóstico de un cáncer de pulmón.