MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE ALERGIA O HIPERSENSIBILIDAD A OPIÁCEOS Y COMPUESTOS ESTRUCTURALMENTE RELACIONADOS.

Métodos de diagnóstico de alergia o hipersensibilidad a opiáceos y compuestos estructuralmente relacionados.

Se describe un método para el diagnóstico de alergia o hipersensibilidad a opiáceos y compuestos estructuralmente relacionados, en particular, opiáceos utilizados en anestesia, y agentes bloqueantes neuromusculares (NMBAs), basado en el uso de extractos hidrosolubles de semillas de Papaver somniferum.

Métodos de diagnóstico de alergia o hipersensibilidad a opiáceos y compuestos estructuralmente relacionados

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se encuadra, en general, dentro del área del diagnóstico de alergias; en particular, en un método para el diagnóstico de alergia o hipersensibilidad a opiáceos y compuestos estructuralmente relacionados, en particular, opiáceos utilizados en anestesia, y agentes bloqueantes neuromusculares (NMBAs) , basado en el uso de extractos hidrosolubles de semillas de Papaver somniferum.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La anestesia es un acto médico controlado en el que se usan fármacos para bloquear la sensibilidad táctil y dolorosa de un paciente, sea en todo o parte de su cuerpo y sea con o sin compromiso de conciencia. La anestesia general se caracteriza por brindar hipnosis, amnesia, analgesia, relajación muscular y abolición de reflejos. Para ello, los anestesistas administran diversos fármacos a los pacientes. En anestesia general se suelen administrar hipnóticos, analgésicos potentes, relajantes musculares y otras sustancias, por ejemplo, anticolinérgicos, benzodiazepinas y anticolinesterásicos que revierten el efecto de los relajantes musculares.

Entre dichos analgésicos se encuentran los opiáceos naturales (morfina) o sintéticos (fentanilo, meperidina, alfentanilo y remifentanilo) , y compuestos relacionados con la morfina, por ejemplo, codeína, heroína, metadona y pholcodina. Entre los relajantes musculares se encuentran los denominados NMBAs (agentes bloqueantes neuromusculares – del inglés “neuromuscular blocking agents”) , que disponen de una estructura iónica de amonio cuaternario y contienen un anillo esquelético hidrófobo y una amina terciaria hidrófila [Fischer MM. et al., Immunoassays for the diagnosis of anaphylaxis to neuromuscular blocking drugs: the value of morphine for the detection of IgE antibodies in allergic subjects. Anaesth Intensive Care 2000; 28:167-70], estructura similar a la de la morfina.

Las reacciones anafilácticas durante la anestesia involucran principalmente a dichos opiáceos y NMBAs (compuestos estructuralmente relacionados con opiáceos) , siendo la causa más frecuente (50 - 70%) de las mismas [Moneret-Vautrin DA. et al., Anaphylaxis to general anesthesis. Chem Immunol Allergy 2010; 95:180-9] por lo que el diagnóstico previo de una presunta hipersensibilidad a los mismos puede salvar la vida a un paciente.

No obstante, realizar un diagnóstico etiológico alergológico de un paciente anestesiado resulta muy difícil ya que las reacciones cutáneas están ocultas bajo las sábanas quirúrgicas, el paciente no se puede quejar de picor o disnea al estar anestesiado, y, además, son múltiples los fármacos que se utilizan. Asimismo, cualquier método de prevención de eventos adversos por fármacos tan utilizados como los opiáceos constituiría una ventaja muy importante en la prevención de reacciones adversas frente a dichos fármacos y tendría una gran repercusión sanitaria y social.

Las pruebas cutáneas (e.g., “Prick Test” e intradermorreacción) , son pruebas in vivo que constituyen uno de los métodos diagnósticos empleados para confirmar las sospechas clínicas de reacciones alérgicas a NMBAs. Sin embargo, las pruebas cutáneas mediante “Prick Test” no han mostrado utilidad diagnóstica cuando se emplean como reactivos opiáceos, tales como morfina (10 mg/mL) , meperidina o petidina (50 mg/mL) y papaveretum [una mezcla de clorhidratos de alcaloides del opio compuesta por 253 partes de clorhidrato de morfina, 23 partes de clorhidrato de papaverina y 20 partes de clorhidrato de codeína (Farmacopea británica – 1993) ] (15, 4 mg/mL) y se ensayan a 4 diluciones a razón de 1:10 [Nasser SM. et al., Opiate-sensititivity: clinical characteristics and the role of skin prick testing. Clin Exp Allergy 2001; 31 (7) :1014-20].

Los métodos in vitro, basados principalmente en la cuantificación de inmunoglobulina E (IgE) específica en suero frente a NMBAs, constituyen otra de las alternativas diagnósticas habitualmente empleadas para evaluar la alergia o hipersensibilidad a NMBAs. Estas pruebas in vitro han puesto de manifiesto la presencia de IgE específica en suero frente a alcuronium, d-tubocurarine, pancuronium y análogos, vecuronium, succinilcolina, decamethonium y galamina en pacientes alérgicos a estos NMBAs [Baldo BA. et al., In vitro diagnosis and studies on the mechanism (s) of anaphylactoid reactions to muscle relaxant drugs. Ann Fr Anesth Reanim 1985; 4 (2) :139-45].

Aunque se han descrito diversos métodos para diagnosticar si un sujeto padece alergia o hipersensibilidad a opiáceos y NMBAs utilizados en anestesia, sigue existiendo la necesidad de desarrollar métodos alternativos que permitan diagnosticar, de una manera objetiva, segura para los pacientes, sencilla y de bajo coste, si un sujeto padece alergia o hipersensibilidad a opiáceos y/o a compuestos estructuralmente relacionados utilizados en anestesia. Ventajosamente, dicho método de diagnóstico debería, además, poseer una elevada sensibilidad y especificidad así como un alto valor predictivo negativo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra el perfil electroforético de los extractos hidrosoluble y liposoluble de semillas de P. somniferum obtenidos según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, determinados mediante SDS-PAGE 15% y tinción con azul de Coomassie. [MWM: Patrón de pesos moleculares. Calle 1: Extracto hidrosoluble obtenido mediante el procedimiento de obtención [1] de un extracto hidrosoluble de la invención. Calle 2: Extracto liposoluble obtenido mediante el procedimiento de obtención [A] de un extracto liposoluble].

La Figura 2 muestra el perfil electroforético del extracto liposoluble de semillas de P. somniferum obtenido según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 (mediante el procedimiento de obtención [A] de un extracto liposoluble) , determinado mediante SDS-PAGE 15% monodimensional (panel derecho - 1D Electroforesis) y bidimensional [2D-SDS-PAGE 15%] (panel izquierdo - 2D Electroforesis) y tinción, en ambos casos, con azul de Coomassie. [MWM: Patrón de pesos moleculares].

La Figura 3 muestra el perfil alergénico de los extractos hidrosoluble y liposoluble de semillas de P. somniferum obtenidos según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, determinados mediante SDS-PAGE 15% y tinción con azul de Coomassie e IgE inmunoblotting. [MWM: Patrón de pesos moleculares. Calle 1: Extracto hidrosoluble. Calle 2: Extracto liposoluble. IgE: Inmunoblotting con pool de sueros de pacientes sensibilizados].

La Figura 4 muestra el perfil alergénico del extracto liposoluble de semillas de P. somniferum obtenido según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, determinado mediante SDS-PAGE 15% bidimensional [2D-SDS-PAGE 15%] (panel izquierdo - 2D Electroforesis) y tinción con azul de Coomassie, e IgE inmunoblotting. Se incluye, además, en el panel derecho (1D Electroforesis) , el perfil electroforético de dicho extracto liposoluble, determinado mediante SDS-PAGE 15% monodimensional y tinción con azul de Coomassie. [MWM: Patrón de pesos moleculares. pI: Punto isoeléctrico. Calle 1 (1D Electroforesis) : Extracto liposoluble].

La Figura 5 muestra los resultados de un Dot Blot para detectar IgE específica de opiáceos en (i) sueros de 6 pacientes alérgicos a derivados morfínicos (opiáceos positivos) , (ii) sueros procedentes de pacientes no alérgicos a derivados morfínicos (opiáceos negativos) ; y sueros de niños prematuros, sueros de recién nacidos y tampón PBS (controles) , utilizando los extractos hidrosolubles y liposoluble de semillas de P. somniferum obtenidos según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

La Figura 6 muestra los resultados de un Dot Blot para detectar IgE específica de opiáceos en (i) suero de un paciente con reacción alérgica severa por aplicación de Atracurio (diluido a 1:4 en el tampón de bloqueo (PBS Tween 0, 5%) ) ; y (ii) mezcla de sueros de 4 pacientes con reacción clínica grave por aplicación de anestésicos: fentanilo, alfentanilo, morfina, propofol, droperidol, tipental y/o ketamina, utilizando los extractos hidrosolubles y liposoluble de semillas de P. somniferum obtenidos según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Como control se utilizó PBS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Ahora se ha encontrado que un extracto de semillas de P. somniferum puede ser utilizado para diagnosticar si un sujeto padece alergia o hipersensibilidad a opiáceos o a compuestos estructuralmente relacionados con opiáceos, en particular, opiáceos y NMBAs utilizados en anestesia. En una realización particular, dicho extracto de semillas... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la obtención de un extracto hidrosoluble de semillas de Papaver somniferum, que comprende las etapas de: a) suspender semillas de P. somniferum en un medio que comprende un tampón con un pH comprendido entre 6 y 9, y glicerol; b) someter las semillas de P. somniferum contenidas en la suspensión obtenida en la etapa a) a un tratamiento de homogeneización, a una temperatura comprendida entre 0ºC y 10ºC, para obtener un homogeneizado de semillas de P. somniferum que comprende (i) una fase sólida que comprende restos celulares de semillas de P. somniferum y (ii) una fase líquida que comprende las sustancias contenidas en dichas semillas; c) someter el homogeneizado obtenido en la etapa b) a agitación a una temperatura comprendida entre 0ºC y 10ºC; d) separar las fases sólida y líquida del homogeneizado resultante de la etapa c) ; e) centrifugar la fase líquida obtenida en la etapa d) entre 7.000 y 13.000 g durante un periodo de tiempo suficiente como para separar una fase acuosa líquida que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum y una fase oleosa sólida o semisólida que comprende un extracto liposoluble de semillas de P. somniferum formado por las sustancias contenidas en las semillas de P. somniferum que no son solubles en medio acuoso; f) separar la fase acuosa que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum obtenida en la etapa e) ; g) filtrar dicha fase acuosa que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum separada en la etapa f) a través de un filtro con un tamaño de poro comprendido entre 0, 8 micrómetros (μm) y 8 μm para obtener un filtrado que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum; y

h) someter dicho filtrado que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum a diálisis frente a agua desionizada con membranas de corte molecular comprendido entre 3.500 Da y 7.000 Da, a una temperatura comprendida entre 0ºC y 10ºC, para obtener un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum.

2. Un procedimiento para la obtención de un extracto hidrosoluble de semillas de Papaver somniferum, que comprende las etapas de: a) poner en contacto semillas de P. somniferum con un disolvente orgánico polar aprótico, a una temperatura comprendida entre 0ºC y 10ºC, para obtener un homogeneizado de semillas de P. somniferum que comprende una fase sólida que comprende restos insolubles de semillas de P. somniferum y una fase líquida que comprende dicho disolvente orgánico polar aprótico y sustancias procedentes de dichas semillas solubles en dicho disolvente orgánico polar aprótico; b) separar dicha fase líquida generada en la etapa a) bajo condiciones que permiten dejar la fase sólida de la etapa a) sustancialmente libre de dicha fase líquida; c) poner en contacto dicha fase sólida de la etapa b) sustancialmente libre de fase líquida con un medio que comprende (i) un tampón con un pH comprendido entre 6 y 9 y (ii) un agente quelante, a una temperatura comprendida entre 0ºC y 10ºC, para extraer la fracción hidrosoluble de las semillas de P. somniferum y generar una suspensión que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum; d) centrifugar la suspensión obtenida en la etapa c) entre 6.000 g y 12.000 g, durante un periodo de tiempo comprendido entre 15 minutos y 2 horas, a una temperatura comprendida entre 0ºC y 10ºC, y separar el sobrenadante que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum; e) filtrar el sobrenadante de la etapa d) que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum a través de un filtro con un tamaño de poro comprendido entre 0, 8 μm y 8 μm para obtener un filtrado que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum; y

f) someter dicho filtrado que comprende un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum obtenido en la etapa e) a diálisis frente a agua desionizada con membranas de corte molecular comprendido entre 3.500 Da y 7.000 Da, a una temperatura comprendida entre 0ºC y 10ºC, para obtener un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum.

3. Un extracto hidrosoluble de semillas de Papaver somniferum obtenible según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

4. Empleo de un extracto según la reivindicación 3 en la elaboración de un reactivo para el diagnóstico de alergia

o hipersensibilidad a un opiáceo o a un compuesto estructuralmente relacionado con un opiáceo.

5. Empleo según la reivindicación 4, en el que dicho opiáceo es un opiáceo utilizado en anestesia.

6. Empleo según la reivindicación 4, en el que dicho opiáceo es heroína.

7. Empleo según la reivindicación 4, en el que dicho compuesto estructuralmente relacionado con un opiáceo es un agente bloqueante neuromuscular (NMBA) .

8. Empleo según la reivindicación 4, en el que dicho extracto se selecciona del grupo formado por un extracto hidrosoluble de semillas de P. somniferum obtenible según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y combinaciones de dichos extractos.

9. Un método in vitro para diagnosticar si un sujeto padece alergia o hipersensibilidad a un opiáceo o a un compuesto estructuralmente relacionado con un opiáceo, que comprende: a) poner en contacto una muestra biológica de dicho sujeto susceptible de contener anticuerpos con un extracto según la reivindicación 3; y b) analizar si se ha producido una interacción entre una IgE específica frente a dicho opiáceo o compuesto estructuralmente relacionado con un opiáceo eventualmente presente en dicha muestra biológica susceptible de contener anticuerpos y dicho extracto;

en donde una interacción entre dicha IgE específica frente a dicho opiáceo y dicho extracto es indicativa de que dicho sujeto padece alergia o hipersensibilidad a dicho opiáceo.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicha muestra biológica susceptible de contener anticuerpos es una muestra de sangre o una muestra de suero.

11. Un kit que comprende un extracto según la reivindicación 3.

12. Uso de un kit según la reivindicación 11, para diagnosticar si un sujeto padece alergia o hipersensibilidad a un opiáceo o a un compuesto estructuralmente relacionado con un opiáceo.

13. Uso de un kit según la reivindicación 12, para diagnosticar si un sujeto padece alergia o hipersensibilidad a un opiáceo utilizado en anestesia, o a un agente bloqueante neuromuscular (NMBA) .

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 4

Fig. 5

Fig. 6