Método de aumento de la replicación del virus influenza.

Método de aumento de la replicación de un virus influenza A reordenante en al menos el 10%,

comprendiendo el método las etapas de:

a) introducir una sustitución de aminoácido en la secuencia de HA del virus reordenante, produciendo deese modo un virus reordenante alterado, en el que la sustitución de aminoácido es treonina en la posición196; y

b) hacer crecer el virus reordenante alterado en huevos.

Método de aumento de la replicación del virus influenza Antecedentes de la invención Los virus influenza están constituidos por un núcleo de ribonucleoproteína interno que contiene un genoma de ARN monocatenario segmentado y una envuelta de lipoproteína externa revestida por una proteína de matriz. Los virus influenza A y B contienen cada uno ocho segmentos de ARN monocatenario con polaridad negativa. El genoma de influenza A codifica para al menos once polipéptidos. Los segmentos 1-3 codifican para los tres polipéptidos que constituyen la ARN polimerasa dependiente de ARN viral. El segmento 1 codifica para la proteína del complejo de polimerasa PB2. Las proteínas de polimerasa restantes PB1 y PA están codificadas por el segmento 2 y el segmento 3, respectivamente. Además, el segmento 1 de algunas cepas de influenza A codifica para una pequeña proteína, PB1-F2, producida a partir de un marco de lectura alternativo dentro de la región que codifica para PB1. El segmento 4 codifica para la glicoproteína de superficie hemaglutinina (HA) implicada en la unión a la célula y la entrada durante la infección. El segmento 5 codifica para el polipéptido de nucleoproteína (NP) de la nucleocápsida, el principal componente estructural asociado con ARN viral. El segmento 6 codifica para una glicoproteína de la envuelta, neuraminidasa (NA) . El segmento 7 codifica para dos proteínas de la matriz, denominadas M1 y M2, que se traducen a partir de ARNm cortado y empalmado de manera alternativa. El segmento 8 codifica para NS1 y NS2 (NEP) , dos proteínas no estructurales, que se traducen a partir de variantes de ARNm cortados y empalmados de manera alternativa.

Los ocho segmentos del genoma de influenza B codifican para 11 proteínas. Los tres genes más grandes codifican para componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica para la proteína HA. El segmento 5 codifica para NP. El segmento 6 codifica para la proteína NA y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de marcos de lectura solapantes de un ARNm biscistrónico. El segmento 7 de influenza B también codifica para dos proteínas: M1 y BM2. El segmento más pequeño codifica para dos productos: NS1 se traduce a partir del ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de una variante de ARNm cortado y empalmado.

Se han producido vacunas que pueden producir una respuesta inmunitaria protectora específica para virus influenza durante más de 50 años. Las vacunas pueden caracterizarse como vacunas de virus completos, vacunas de virus divididos, vacunas de antígenos de superficie y vacunas de virus atenuados vivos. Aunque formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacunas pueden producir una respuesta inmunitaria sistémica, las vacunas de virus atenuados vivos también pueden estimular la inmunidad mucosa local en las vías respiratorias.

FluMist™ es una vacuna atenuada, viva que protege a niños y adultos de la enfermedad de la gripe (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children, N Engl J Med 338:1405-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44) . Las cepas de la vacuna FluMist™ contienen segmentos génicos de HA y NA derivados de las cepas de tipo natural actualmente circulantes junto con seis segmentos génicos, PB1, PB2, PA, NP, M y NS, de un virus donador maestro (VDM) común. El VDM para las cepas de influenza A de FluMist (VDM-A) se creó mediante pase en serie de la cepa A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) wt (tipo natural, (“wild type”) ) en cultivo de tejido de riñón de pollo primario a temperaturas sucesivamente inferiores (Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213: 612-4) . VDM-A se replica eficazmente a 25ºC (ca, adaptado al frío (“cold adapted”) ) , pero su crecimiento se restringe a 38 y 39ºC (ts, sensible a la temperatura (“temperature sensitive”) ) . Adicionalmente, este virus no se replica en los pulmones de hurones infectados (att, atenuación (“attenuation”) ) . Se cree que el fenotipo ts contribuye a la atenuación de la vacuna en seres humanos restringiendo su replicación en todas excepto las regiones más frías de las vías respiratorias. La estabilidad de esta propiedad se ha demostrado en modelos animales y estudios clínicos. En contraposición al fenotipo ts de cepas de influenza creadas por mutagénesis química, la propiedad ts de VDM-A no revirtió tras el pase a través de hámsteres infectados o en aislados propagados de niños (para una revisión reciente, véase Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15:295-323) .

Estudios clínicos en más de 20.000 adultos y niños que implicaban 12 cepas reordenantes 6:2 separadas han mostrado que estas vacunas están atenuadas, son seguras y eficaces (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children, N Engl J Med 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults, Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease, J Infect Dis 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy working adults: a randomized controlled trial, JAMA 282:137-44) . Los reordenantes que portan los seis genes internos de VDM-A y los dos segmentos génicos de HA y NA del virus wt (reordenante 6:2) mantienen de manera constante los fenotipos ca, ts y att (Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets, J Infect Dis 146:780-900) .

Hasta la fecha, todas las vacunas de influenza disponibles comercialmente en los Estados Unidos se han propagado

en huevos de gallina embrionados. Aunque el virus influenza crece bien en huevos de gallina, la producción de vacuna depende de la disponibilidad de huevos. Los suministros de huevos deben estar organizados, y las cepas para la producción de vacunas seleccionarse meses de antemano de la siguiente temporada de gripe, limitando la flexibilidad de este enfoque, y dando como resultado a menudo retrasos y escasez de producción y distribución. Desafortunadamente, algunas de cepas de vacunas de influenza, tales como la cepa A/Fujian/411/02 prototipo que circuló durante la temporada 2003-04, no se replican bien en huevos de pollo embrionados, y se han tenido que aislar mediante cultivo celular, un procedimiento costoso y que requiere mucho tiempo. La presente invención proporciona además una nueva tecnología para aumentar la capacidad de cepas de vacuna para replicarse en huevos de pollo embrionados. Además, la presente invención permite una producción más eficaz y económica de vacunas de influenza.

También se han desarrollado sistemas para producir virus influenza en cultivo celular en los últimos años (véase, por ejemplo, Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza págs. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines págs. 141-151) . Normalmente, estos métodos implican la infección de células huésped inmortalizadas adecuadas con una cepa de virus seleccionada. Aunque se eliminan muchas de las dificultades relacionadas con la producción de vacunas en huevos de gallina, no todas las cepas patógenas de influenza crecen bien y pueden producirse según métodos de cultivo tisular establecidos. Además, muchas cepas con características deseables, por ejemplo, atenuación, sensibilidad a la temperatura y adaptación al frío, adecuadas para la producción de vacunas atenuadas vivas, no se han hecho crecer satisfactoriamente en cultivo tisular usando métodos establecidos.

La producción de virus influenza a partir de ADN recombinante aumentaría significativamente la flexibilidad y utilidad de métodos de cultivo tisular para la producción de vacunas de influenza. Recientemente, se han notificado sistemas para producir virus influenza A a partir de plásmidos recombinantes que incorporan ADNc que codifican para el genoma viral (véase, por ejemplo, Neumann et al. (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96:9345-9350; Fodor et al. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.... [Seguir leyendo]

1. Método de aumento de la replicación de un virus influenza A reordenante en al menos el 10%, comprendiendo el método las etapas de:

a) introducir una sustitución de aminoácido en la secuencia de HA del virus reordenante, produciendo de ese modo un virus reordenante alterado, en el que la sustitución de aminoácido es treonina en la posición 196; y

b) hacer crecer el virus reordenante alterado en huevos.