Membrana de ensayo y método de uso de la misma.

Una membrana microporosa para la detección de al menos un analito diana en una muestra,

quecomprende una matriz que comprende al menos un elemento de captura y cinco elementos de control impresos enla superficie de la membrana, en donde el elemento de captura, al menos uno, se corresponde y es capaz de unirsea un analito diana, en donde la pluralidad de elementos de control comprende:

i) al menos un marcador de confianza,

ii) al menos un testigo negativo para supervisar la señal de fondo,

iii) al menos un testigo negativo para supervisar la especificidad del ensayo,

iv) al menos un testigo colorimétrico positivo, y/o

v) al menos un testigo positivo para supervisar la eficiencia del ensayo.

Membrana de ensayo y método de uso de la misma.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para la detección colorimétrica de al menos un analito en una muestra, 5 preferiblemente múltiples analitos en una muestra, y a membranas para uso en el método.

Información general

Los biomarcadores pueden identificar una enfermedad antes de mostrarse los síntomas clínicos en un sujeto y, por lo tanto, proporcionan la capacidad de tratar la base molecular de la enfermedad mediante terapias dirigidas. Por ello, los biomarcadores permiten que los efectos farmacodinámicos de terapias dirigidas se evalúen antes de que sean evidentes los signos y los síntomas clínicos.

Se están descubriendo nuevos biomarcadores por medio de una gran variedad de estudios proteómicos y genómicos, utilizando, tecnologías muy laboriosas de bajo rendimiento, tales como espectrometría de masas y cromatografía líquida de alto rendimiento. Estas tecnologías son una gran herramienta de detección para identificar nuevos biomarcadores en un pequeño número de muestras procedentes de sujetos. Sin embargo, los biomarcadores deben estar capacitados para someter a ensayo un gran número de muestras procedentes de sujetos, antes de ser aceptados como un biomarcador clínicamente válido. Actualmente, las tecnologías disponibles para el escrutinio de un gran número de muestras de sujetos son costosas y complicadas.

Los inmunoensayos colorimétricos se consideran frecuentemente el patrón aceptado para la medición de una sola proteína. Estos ensayos implican típicamente un anticuerpo principal específico de un antígeno que se une al

antígeno diana de la muestra, detectando la unión del antígeno utilizando un anticuerpo secundario ligado a un sistema de detección colorimétrica. El formato más utilizado son los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) , que tienen protocolos bien establecidos para la medición de proteínas individuales en soluciones.

Existe una necesidad de pruebas de diagnóstico sencillas, rápidas y rentables que se puedan usar para detectar biomarcadores en muestras biológicas. El interés cada vez mayor en la medición simultánea de múltiples proteínas 25 en muestras, ha conducido al desarrollo de inmunoensayos multiplexados en un formato de micromatriz. Las micromatrices basadas en proteínas se emplean en la actualidad para una variedad de aplicaciones. Sin embargo, esta tecnología todavía no se ha adoptado como un método de rutina para pruebas de diagnóstico, debido a dificultades técnicas en el área de la sensibilidad, la especificidad y la reactividad cruzada de los reactivos del ensayo y la necesidad de una instrumentación costosa. En consecuencia, se necesitan tecnologías que puedan desarrollarse rápidamente y poner en práctica métodos de ensayo adaptados a un alto rendimiento, un escrutinio ajustado y rentable para validar la utilidad de los biomarcadores en grandes segmentos de la población.

Compendio de la invención La invención solo está limitada por sus reivindicaciones.

Un aspecto de la invención se refiere a una membrana microporosa para la detección de al menos un analito diana en una muestra, en donde la membrana comprende una matriz que comprende al menos un elemento de captura y, opcionalmente, una pluralidad de elementos de control esparcidos, impresos o similares, sobre la superficie de la membrana, en donde el elemento de captura, al menos uno, se corresponde con un analito diana y es capaz de unirse al mismo. La pluralidad de elementos de control, cuando se incluyen opcionalmente, puede comprender:

i) al menos un marcador de confianza,

ii) al menos un testigo negativo para supervisar la señal de fondo,

iii) al menos un testigo negativo para supervisar la especificidad del ensayo,

iv) al menos un testigo colorimétrico positivo,

v) al menos un testigo positivo para supervisar la eficiencia del ensayo o cualquiera de sus combinaciones.

Aunque la presente invención se describe haciendo referencia al uso de colorimetría y testigos colorimétricos, se 45 debe entender que se pueden emplear otros sistemas de detección. Por ejemplo, se pueden usar colorantes fluorescentes tales como Texas Red y sustratos enzimáticos que generan una señal quimioluminiscente.

Otro aspecto de la invención se refiere a una membrana microporosa para detectar una pluralidad de analitos diana en una muestra, en donde la membrana comprende una matriz de elementos de captura impresos en la superficie de la membrana, en donde cada elemento de captura se corresponde con un analito diana y es capaz de unirse al

mismo. Opcionalmente, la matriz puede incluir además una pluralidad de elementos de control que comprenden: i) al menos un marcador de confianza,

ii) al menos un testigo negativo para supervisar la señal de fondo,

iii) al menos un testigo negativo para supervisar la especificidad del ensayo,

iv) al menos uno testigo colorimétrico positivo,

v) al menos un testigo positivo para supervisar la eficiencia del ensayo, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización, la matriz de elementos de captura comprende una pluralidad de grupos de elementos de captura, en donde cada elemento de captura dentro de un grupo es capaz de unirse al mismo analito diana, y en donde cada grupo de elementos de captura es capaz de unirse a un analito diana diferente de cualquier otro grupo de elementos de captura. En una realización alternativa, la matriz de elementos de captura comprende una pluralidad de parejas de elementos de captura, en donde cada elemento de captura en una pareja es capaz de unirse al mismo analito diana, en donde cada pareja de elementos de captura es capaz de unirse a un analito diana diferente de cualquier otra pareja de elementos de captura.

En una realización, la pluralidad de grupos de elementos de captura es capaz de unirse a una pluralidad de analitos diana, en donde la pluralidad de analitos diana comprende uno o varios paneles de analitos diana indicativos de una 15 o varias enfermedades o trastornos humanos, tal y como se expone en la Tabla 1. En una realización alternativa, la pluralidad de grupos de elementos de captura es capaz de unirse a una pluralidad de analitos diana, en donde la pluralidad de analitos diana comprende uno o varios paneles de analitos diana y determina la eficacia de uno o varios tratamientos, tal y como se expone en la Tabla 2. En otra realización alternativa, la pluralidad de grupos de elementos de captura es capaz de unirse a una pluralidad de analitos diana, en donde la pluralidad de analitos diana comprende uno o varios paneles de analitos diana para someter a ensayo animales, tal y como se expone en la Tabla 3. En otra realización alternativa, la pluralidad de analitos diana representa una combinación de dos paneles cualquiera o más, tal y como se expone en las Tablas 1-3.

En una realización el analito diana se selecciona a partir de una proteína, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un fragmento de polipéptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un dominio que se une a 25 anticuerpo, un antígeno, un fragmento de antígeno, un determinante antigénico, un epítopo, un hapteno, un inmunógeno, un fragmento de inmunógeno, un ión metálico, una molécula revestida con iones metálicos, biotina, avidina, estreptavidina, un inhibidor, un cofactor, un sustrato, una enzima, un receptor, un fragmento de receptor, una subunidad de receptor, un fragmento de una subunidad de receptor, un ligando, un ligando de receptor, un agonista de receptor, un antagonista de receptor, una molécula de señalización, una proteína de señalización, un 30 fragmento de proteína de señalización, un factor de crecimiento, un fragmento de factor de crecimiento, un factor de transcripción, un fragmento de factor de transcripción, un inhibidor, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, una glicoproteína, un lípido, una célula, una proteína de la superficie celular, un lípido de la superficie celular, un carbohidrato de la superficie celular, una glicoproteína de la superficie celular, un extracto celular, un virus, una proteína de la cubierta vírica, una hormona, una proteína sérica, una proteína de la leche, un oligonucleótido, una macromolécula, una droga, o cualquier combinación de dos cualesquiera o más de los mismos.

En una realización el elemento de captura se selecciona a partir de una proteína, un fragmento de proteína, una proteína de unión (BP, del inglés “binding protein”) , un fragmento de proteína de unión, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo, una cadena ligera de anticuerpo, un anticuerpo de cadena... [Seguir leyendo]

1. Una membrana microporosa para la detección de al menos un analito diana en una muestra, que comprende una matriz que comprende al menos un elemento de captura y cinco elementos de control impresos en la superficie de la membrana, en donde el elemento de captura, al menos uno, se corresponde y es capaz de unirse a un analito diana, en donde la pluralidad de elementos de control comprende:

i) al menos un marcador de confianza,

ii) al menos un testigo negativo para supervisar la señal de fondo,

iii) al menos un testigo negativo para supervisar la especificidad del ensayo,

iv) al menos un testigo colorimétrico positivo, y/o v) al menos un testigo positivo para supervisar la eficiencia del ensayo.

2. La membrana según la reivindicación 1, en donde la membrana es para detectar una pluralidad de analitos diana en una muestra, comprendiendo la membrana una matriz de elementos de captura impresa en la superficie de la membrana, correspondiéndose cada elemento de captura y siendo capaz de unirse a un analito diana.

3. La membrana microporosa según la reivindicación 2, en donde la matriz de elementos de captura

comprende una pluralidad de grupos de elementos de captura, siendo capaz cada elemento de captura dentro de un grupo de unirse al mismo analito diana, y siendo capaz cada grupo de elementos de captura de unirse a un analito diana diferente del de cualquier otro grupo de elementos de captura.

4. La membrana microporosa según la reivindicación 2, en donde la matriz de elementos de captura comprende una pluralidad de parejas de elementos de captura, siendo capaz cada elemento de captura en una pareja de unirse al mismo analito diana, y siendo capaz cada pareja de elementos de captura de unirse a un analito diana diferente del de cualquier otra pareja de elementos de captura.

5. La membrana microporosa según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la pluralidad de grupos de elementos de captura es capaz de unirse a una pluralidad de analitos diana, en donde la pluralidad de analitos diana comprende uno o varios paneles de analitos diana indicativos de una o varias enfermedades o afecciones humanas como las que se exponen en la Tabla 1.

6. La membrana microporosa según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la pluralidad de grupos de elementos de captura es capaz de unirse a una pluralidad de analitos diana, en donde la pluralidad de analitos diana comprende uno o varios paneles de analitos diana para determinar la eficacia de uno o varios tratamientos, como los que se exponen en la Tabla 2.

7. La membrana microporosa según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde la pluralidad de grupos de elementos de captura es capaz de unirse a una pluralidad de analitos diana, en donde la pluralidad de analitos diana comprende uno o varios paneles de analitos diana para someter a ensayo a animales como los que se exponen en la Tabla 3.

8. La membrana microporosa según la reivindicación 2, en donde el analito diana se selecciona a partir de una proteína, un fragmento de proteína, un péptido, un polipéptido, un fragmento de polipéptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un dominio que se une a anticuerpo, un antígeno, un fragmento de antígeno, un determinante antigénico, un epítopo, un hapteno, un inmunógeno, un fragmento de inmunógeno, un ión metálico, una molécula revestida con iones metálicos, biotina, avidina, estreptavidina, un inhibidor, un cofactor, un sustrato, una enzima, un receptor, un fragmento de receptor, una subunidad de receptor, un fragmento de una subunidad de receptor, un ligando, un ligando de receptor, un agonista de receptor, un antagonista de receptor, una molécula de señalización, una proteína de señalización, un fragmento de proteína de señalización, un factor de crecimiento, un fragmento de factor de crecimiento, un factor de transcripción, un fragmento de factor de transcripción, un inhibidor, un monosacárido, un oligosacárido, un polisacárido, una glicoproteína, un lípido, una célula, una proteína de la superficie celular, un lípido de la superficie celular, un carbohidrato de la superficie celular, una glicoproteína de la 45 superficie celular, un extracto celular, un virus, una proteína de la cubierta vírica, una hormona, una proteína sérica, una proteína de la leche, una macromolécula, una droga, un oligonucleótido o cualquier combinación de dos cualesquiera o más de los mismos.

9. La membrana microporosa según la reivindicación 2, en donde el elemento de captura se selecciona a partir de una proteína, un fragmento de proteína, una proteína de unión (BP) , un fragmento de proteína de unión, un 50 anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una cadena pesada de anticuerpo, una cadena ligera de anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo de dominio único (un VHH, por ejemplo) , un fragmento de anticuerpo Fab, un fragmento de anticuerpo Fc, un fragmento de anticuerpo Fv, un fragmento de anticuerpo F (ab') 2, un fragmento de anticuerpo Fab', un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla (scFv) , un dominio que se une a anticuerpo, un antígeno, un determinante antigénico, un epítopo, un hapteno, un inmunógeno, un fragmento de inmunógeno, un dominio de unión; biotina, una avidina, una estreptavidina; un sustrato, una enzima, una abzima, un cofactor, un receptor, un fragmento de receptor, una subunidad de receptor, un fragmento de una subunidad de receptor, un ligando, un inhibidor, una hormona, un sitio de unión, una lectina, una polihistidina, un dominio de acoplamiento, un oligonucleótido, o una combinación de dos cualesquiera o más de los mismos.

10. La membrana según la reivindicación 1, en donde la membrana está fijada de forma movible a la placa de microtitulación sin fondo.

11. Un kit para detectar una pluralidad de analitos diana en una muestra, que comprende: a) una membrana microporosa según la reivindicación 2, y, opcionalmente, uno o ambos de los siguientes elementos:

b) un reactivo reductor del ruido de fondo, y c) un sistema de detección colorimétrica.

12. El kit según la reivindicación 11, que comprende además uno o varios elementos seleccionados entre el grupo que consiste en: a) una solución de lavado, 15 b) uno o varios anticuerpos para la detección de antígenos, ligandos o anticuerpos unidos a los elementos de captura o para la detección de los testigos positivos,

c) un programa informático para el análisis de los analitos diana capturados, y d) un protocolo para medir la presencia de analitos diana en las muestras.

13. El kit según la reivindicación 12, en donde los anticuerpos de detección comprenden conjugados de anticuerpo-proteína de unión (BP) , conjugados de anticuerpo-marcador enzimático o cualquier combinación de los mismos.

14. Un método para el procesamiento de una micromatriz que comprende a) proporcionar una membrana microporosa según la reivindicación 2, b) añadir al menos una muestra a la membrana, y

c) procesar la membrana de tal manera que se proporcione un resultado detectable mediante dos o más de los siguientes elementos: i) al menos un marcador de confianza, ii) al menos un testigo colorimétrico positivo, y iii) al menos un testigo positivo para supervisar la eficiencia del ensayo.

15. Un método para detectar un analito en una muestra que comprende proporcionar una membrana según la reivindicación 1, añadir al menos una muestra a la membrana y procesar la membrana de tal manera que se proporcione un resultado detectable.

16. El método según la reivindicación 15, en el que el resultado detectable incluye dos o más de al menos un marcador de confianza, al menos un testigo colorimétrico positivo y al menos un testigo positivo para detectar un 35 analito en la muestra.

17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en donde el marcador de confianza se emplea para orientar y reticular la matriz.