Medios y métodos para romper interacciones de unión no covalentes entre moléculas.

Una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), que comprende un antígeno peptídico en elsurco de unión a péptidos de la molécula de MHC, por lo cual un grupo condicionalmente reactivo está presente enel antígeno peptídico que, cuando se activa por una señal física o química, rompe un enlace covalente dentro dedicho antígeno peptídico, que garantiza la liberación del antígeno peptídico de la molécula de MHC, y en la quedicho grupo condicionalmente reactivo comprende un grupo sensible a la luz o sensible al peryodato.

Medios y métodos para romper interacciones de unión no covalentes entre moléculas.

La invención se refiere al campo de la unión entre moléculas. La invención, en concreto, se refiere a medios y métodos para romper interacciones no covalentes entre miembros de una molécula proteica multimérica.

Las interacciones no covalentes son muy importantes, en especial en el campo de la biología. La unión no covalente mantiene unidas las dos hebras de la doble hélice del ADN (enlaces de hidrógeno) , pliega a los polipéptidos para producir estructuras secundarias, tales como el alfa-hélica y la conformación beta, permite que las enzimas se unan a su sustrato, permite que los anticuerpos se unan a su antígeno, permite que los factores de transcripsción se unan entre sí, permite que los factores de transcripción se unan al ADN, permite que las proteínas (por ejemplo, algunas hormonas) se unan a su receptor, permite el ensamblaje de la maquinaria macromolecular, tal como ribosomas, filamentos de actina, microtúbulos y muchos más.

Existen tres tipos principales de fuerzas no covalentes, a saber, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas y enlaces de hidrógeno.

Ejemplos de interacciones iónicas en interacciones de las proteínas A cualquier pH concreto, las proteínas tienen grupos cargados que pueden participar en su union entre sí o a otros tipos de moléculas. Por ejemplo, los grupos carboxilo cargados negativamente en los restos ácido aspártico (Asp) y ácido glutámico (Glu) pueden ser atraídos por los grupos amino protonados cargados positivamente en los restos lisina (Lys) y arginina (Arg) .

Las interacciones iónicas son muy sensibles a los cambios en el pH. A medida que el pH disminuye, se unen H+ a los grupos carboxilo (COO-) del ácido aspártico (Asp) y del ácido glutámico (Glu) , neutralizando su carga negativa, y se unen H+ al par de electrones no ocupados del átomo de N de los grupos amino (NH2) de la lisina (Lys) y la arginina (Arg) , otorgándolas una carga positiva. El resultado es que no sólo cambia la carga neta de la molécula (se hace más positiva) , sino que se alteran muchas de las posibilidades que tiene su cadena lateral o los grupos de la cadena principal para participar en interacciones iónicas (electrostáticas) con otras moléculas e iones. A medida que aumenta el pH, se retiran H+ de los grupos COOH de Asp y Glu, otorgándoles una carga negativa (COO-) , y se retiran H+ de los grupos NH3+ de Lys y Arg, eliminando su carga positiva. El resultado es que cambia la carga neta de la molécula (se hace más negativa) y, de nuevo, se alteran muchas de las posibilidades que tiene su cadena lateral o los grupos de la cadena principal para participar en interacciones electrostáticas con otras moléculas o iones.

Las interacciones iónicas también son sensibles a la concentración salina. El aumento de la concentración salina reduce la fuerza del enlace iónico proporcionando iones que compiten por los restos cargados.

Ejemplos de interacciones hidrófobas en interacciones de las proteínas Las cadenas laterales (grupos R) de aminoácidos tales como fenilalanina y leucina son no polares y, por tanto, interaccionan mal con moléculas polares, tales como el agua. Por esta razón, la mayoría de los restos no polares en proteínas globulares se dirigen hacia el interior de la molécula, mientras que los grupos polares, tales como ácido aspártico y lisina, están sobre la superficie expuesta al disolvente. Cuando los restos no polares están expuestos sobre la superficie de dos moléculas diferentes, es energéticamente más favorable para sus dos superficies no polares “oleosas” que ambas se aproximen mucho, desplazando a las moléculas de agua polares que están entre ambas.

La fuerza de las interacciones hidrófobas no se ve afectada de forma apreciable por los cambios en el pH o en la concentración salina.

Ejemplos de enlaces de hidrógeno en interacciones de las proteínas Los enlaces de hidrógeno puede formarse cuando un átomo fuertemente electronegativo (por ejemplo, oxígeno, nitrógeno) se acerca a un átomo de hidrógeno, que está unido covalentemente a un segundo átomo fuertemente electronegativo.

Algunos ejemplos habituales son: entre el grupo -C=O y los grupos H-N- de distintos enlaces peptídicos en proteínas (que producen el alfa-hélice y la configuración beta) ; entre grupos -C=O y grupos hidroxilo (H-O-) en los restos serina y treonina y los grupos SH de la cisteína en proteínas y en azúcares.

Una característica de las interacciones no covalentes es que individualmente son débiles pero colectivamente son fuertes. Las tres formas de interacciones no covalentes son individualmente débiles (del orden de 5 kcal/mol) comparadas con un enlace covalente (con 90-100 kcal/mol de energía de unión) . Existen ciertos tipos de enlaces con una energía de enlace intermedia (es decir, entre 15 y 70 kcal/mol) . Para la presente invención, estos tipos de enlaces se consideran no covalentes si en sí mismos son insuficientes para asociar a dos moléculas proteicas en un

entorno concreto. En otras palabras, los enlaces no covalentes son aquellos en los que es necesario un número sustancial de interacciones que trabajan juntas para mantener unidas las estructuras. La fuerza limitada que tienen estas interacciones requiere que los grupos que interaccionan puedan acercarse mucho (un angstrom o menos) .

Así, se dice que un multímero que comprende dos o más miembros, en un aspecto, se mantiene unido por enlaces no covalentes si dos o más miembros están unidos por al menos 3 y preferiblemente al menos 5 enlaces que tienen cada uno una energía de enlace menor que 90-100 kcal/mol. Un enlace disulfuro de cisteínas típico que une a dos cadenas proteicas tienen una energía de enlace de aproximadamente 65 kcal/mol. Sin embargo, la fuerza de este enlace depende mucho del entorno reductor/oxidante. Así, para la presente invención, se dice que un multímero se mantiene unido por enlaces no covalentes cuando los enlaces que unen las dos o más cadenas de los miembros tienen cada uno una energía de enlace menor que 65 kcal/mol, y generalmente menor que 20 kcal/mol. Habitualmente, cada uno de dichos enlaces tiene una energía de enlaces de aproximadamente 5 kcal/mol. Así, dos o más miembros en un multímero que se mantienen unidos por enlaces no covalentes presentan un número sustancial de interacciones no covalentes trabajando juntas para mantener unidas las estructuras, y tienen una topografía superficial que permite que áreas sustanciales de dichas al menos dos superficies en interacción se acerquen mucho, es decir, deben encajar entre sí.

La presente invención utiliza la característica de que son necesarios muchos enlaces débiles para mantener unidas las estructuras en una molécula proteica multimérica por medio de una región de interacción no covalente. En la presente invención, al menos un miembro implicado en dicha interacción no covalente en el multiméro se escinde en al menos dos miembros nuevos rompiendo al menos un enlace covalente en dicho al menos un miembro del multímero. La ruptura de un enlace covalente produce un multímero que tiene un miembro más que el multímero original. La ruptura de dos enlaces covalentes produce un multímero que tiene dos miembros más, etc. La ruptura de al menos un enlace covalente en el multímero produce una disminución en el número de interacciones no covalentes por miembro del multímero. En la presente invención, esta reducción se utiliza para provocar la disociación de al menos un miembro del multímero. En la presente invención, la ruptura de un enlace covalente se utiliza para reducir el número de enlaces no covalentes por miembro del multímero, de modo que los enlaces no covalentes son insuficientes para mantener la integridad del multímero, o se utiliza la ruptura de un enlace covalente para alterar la conformación del miembro en el que se ha producido esta modificación y con ello provoca la liberación de al menos un miembro del multímero. Después de la liberación de al menos un miembro del multímero, los miembros resultantes pueden ser monómeros, multímeros o sus combinaciones. La ruptura de un enlace covalente en un péptido puede lograrse por medios enzimáticos, medios químicos o medios físicos. La ruptura de un enlace covalente, según se utiliza en la invención, es preferiblemente química o física, es decir, preferiblemente no enzimática. Más preferiblemente, la ruptura de un enlace puede inducirse por medios químicos o por la luz. También se prefiere que se rompa un enlace covalente en el esqueleto peptídico. Un enlace covalente que preferiblemente se rompe es un enlace colocado junto a un enlace peptídico (por tanto, un enlace... [Seguir leyendo]

1. Una molécula del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) , que comprende un antígeno peptídico en el surco de unión a péptidos de la molécula de MHC, por lo cual un grupo condicionalmente reactivo está presente en el antígeno peptídico que, cuando se activa por una señal física o química, rompe un enlace covalente dentro de dicho antígeno peptídico, que garantiza la liberación del antígeno peptídico de la molécula de MHC, y en la que dicho grupo condicionalmente reactivo comprende un grupo sensible a la luz o sensible al per y odato.

2. La molécula de MHC según la reivindicación 1, en la que dicho grupo sensible a la luz comprende el ácido 3amino-3- (2-nitrofenil) propiónico o cualquiera de sus equivalentes funcionales.

3. La molécula de MHC según la reivindicación 1, en la que dicho grupo sensible al per y odato comprende un resto dihidroxi.

4. Una composición que comprende una molécula de MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Una composición según la reivindicación 4, que comprende además otro péptido.

6. Una composición según la reivindicación 5, en la que dicho otro péptido es un péptido antigénico capaz de unirse al surco de unión a péptidos de dicha molécula de MHC.

7. Un método para producir una molécula de MHC, que comprende a) producir una molécula de MHC que comprende un péptido temporal que tiene al menos un grupo condicionalmente reactivo que, cuando se activa, rompe dicho péptido temporal en al menos dos péptidos más pequeños que muestran una menor afinidad de unión por dicha molécula de MHC, en el que dicho grupo condicionalmente reactivo comprende un grupo sensible a la luz

o sensible al per y odato; b) activar dicho grupo condicionalmente reactivo; y c) proporcionar a la molécula de MHC un péptido deseado para su unión al surco de unión a péptidos de dicha molécula de MHC bajo condiciones que retiran de modo eficaz el péptido temporal escindido de dicha molécula de MHC.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la inducción del grupo condicionalmente reactivo, la disociación de los fragmentos del péptido escindidos y la asociación del péptido deseado a la molécula de MHC se realiza en una etapa.

9. Un complejo que comprende al menos dos moléculas de MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

10. Una superficie sólida que comprende al menos dos moléculas de MHC según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, que comprende además detectar la unión de dicho péptido deseado a dicha molécula de MHC.

12. Un método según la reivindicación 11, en el que dicha unión se detecta mediante la detección de un marcador que está asociado con dicho péptido deseado.

13. El método según la reivindicación 12, en el que dicho péptido deseado comprende dicho marcador.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que dicha unión de dicho péptido deseado a dicha molécula de MHC se mide por medio de anisotropía de fluorescencia.

15. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, para determinar la unión de dicho péptido deseado en presencia de un compuesto de ensayo o de referencia.