Procedimiento para la separación de células.

Célula que contiene un gen que no está presente en esta forma en un tipo salvaje de la célula,

y que codifica unmarcador de superficie extracelular transgénico condicional que es detectable sobre la superficie de la célula,

en la que el gen que codifica un marcador de superficie transgénico condicional comprende:

(i) un promotor para dirigir la transcripción de una primera secuencia de transcripción, enlazado funcionalmentea

(ii) una primera secuencia de transcripción para evitar la transcripción de una segunda secuencia detranscripción, y

(iii) una segunda secuencia de transcripción que codifica el marcador de superficie, que comprende

(a) un dominio de asociación de membrana o transmembrana para anclar el marcador de superficie en lamembrana celular, y

(b) una segunda secuencia de etiqueta para tornar una célula clasificable,

de manera que la primera secuencia de transcripción es extraíble condicionalmente de forma que lasegunda secuencia de transcripción puede ser transcrita, y

de manera que el marcador de superficie torna la célula clasificable a través de la detección del marcadorde superficie transgénico condicional sobre la superficie de la célula.

Procedimiento para la separación de células.

La presente invención se refiere a una célula que contiene un gen que no está presente en esta forma en un tipo natural de célula, y que codifica un marcador de superficie transgénico condicional que es detectable durante la expresión del marcador en la superficie celular. Además, la invención se refiere a un constructo para generar este tipo de célula y a un procedimiento para la separación de esta célula de una población celular.

Antecedentes de la invención La separación y el aislamiento de tipos de célula específicos en el contexto de organismos completos permite su cultivo por separado y el análisis molecular así como funcional. Esto ha resultado ser muy útil para la comprensión de las poblaciones de células específicas y de su interacción con otras células pero también para su manipulación y su uso terapéutico.

Se han formulado muchos procedimientos para analizar y clasificar las poblaciones celulares, que incluyen de manera no limitativa procedimientos que utilizan el tamaño, la densidad o la granulidad de una célula para una separación mediante sedimentación que se puede realizar por sí misma o en combinación con gradientes de densidad y centrifugación o elutriación. Otros procedimientos se basan en las diferencias de resistencia de las células a la lisis osmótica para la separación de, por ejemplo, los leucocitos de la sangre. Además, se pueden utilizar los procedimientos de depleción de células no deseadas utilizando anticuerpos tóxicos específicos con un marcador de superficie celular. Otros procedimientos incluyen, por ejemplo, la citometría de flujo o la separación magnética de células (por ejemplo, utilizando anticuerpos conjugados con microesferas magnéticas, por ejemplo, MACS, Miltenyi Biotec) y otros procedimientos que dependen de la afinidad del anticuerpo a moléculas de superficie específicas como las proteínas. Utilizando estas últimas técnicas, se puede conseguir un enriquecimiento positivo o depleción de las células que expresan una molécula en concreto que incluye de manera no limitativa ARN, ADN, lípido, azúcar o proteína.

Se ha descrito que una proteína verde fluorescente (GFP) expresada de forma recombinante se puede colocar en la cara citosólica de la membrana plasmática de las células madre embrionarias de ratones gracias a un sitio de palmitoilación que está presente en la GFP recombinante. Se ha especulado que las células que expresan estas proteínas GFP se pueden separar de las células que no expresan esta GFP recombinante utilizando el separador de células activadas por fluorescencia (FACS) (Schindehütte et. al. (2005) Stem Cells 23:10-15) .

Tanto en la citometría de flujo como en la separación magnética de células, el marcador de la proteína se etiqueta a través de un anticuerpo específico que a su vez está unido directa o indirectamente a un colorante fluorescente o a una partícula superparamagnética (microesfera) . Se pueden utilizar tanto los marcadores intracelulares como los extracelulares. Sin embargo, cuando se necesita obtener células vivas, entonces sólo se pueden utilizar marcadores extracelulares ya que la célula ha de estar fijada y permeabilizada para la tinción intracelular.

Por consiguiente, hasta ahora sólo estos tipos de células no transgénicas eran accesibles para una separación magnética de células, y la citometría de flujo de células vivas en el contexto de un organismo completo en el que los marcadores de superficie eran conocidos y específicos, y en el que estaban disponibles anticuerpos de alta afinidad (Recktenwald and Radbruch, Cell Separation Methods and Applications (1998) , 153-174) .

Tal como se ha indicado, muchos tipos adicionales de células se caracterizan mediante los marcadores intracelulares como las proteínas citoesqueléticas, los factores de transcripción, proteínas específicas de orgánulos, enzimas, etc. (Berhuis et al. (2004) Int. J Dev Neurosci 22:533-43) .

Entre otros, estos marcadores intracelulares se han utilizado para generar líneas de ratones que expresan un indicador específico del tipo de célula utilizando el promotor respectivo (Suzuki et al. (2003) Neurosci. Res. 47:451454; Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236; Zambrowicz et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3789-94; David et al. (2005) Stem Cells 23:477-482) .

Además, algunos tipos de célula se caracterizan además o solamente por parámetros espacio-temporales. Esto quiere decir que estas células no se caracterizan, o no sólo se caracterizan por la expresión del marcador sino por su aparición limitada durante un cierto periodo de tiempo. Por ejemplo, las células presentes sólo en la amígdala del cerebro, las células que tienen alguna función sólo durante el periodo posnatal temprano, células que tienen alguna función después de la lesión de un órgano, o células que cambian su comportamiento después de un tratamiento con fármacos.

Sin embargo, el indicador utilizado en combinación con marcadores intracelulares o con propiedades espaciotemporales hasta ahora son o bien indicadores de fluorescencia (como la proteína verde fluorescente (GFP) , la proteína fluorescente amarilla (YFP) , etc.) u otros indicadores que se pueden utilizar para teñir una células (por ejemplo, la beta galactosidasa) . En algunos casos, se han introducido transgénicos que permiten una depleción de una línea celular específica mediante la expresión del receptor de la toxina de la difteria (DTR) (Buch et al. (2005) Nature Methods 2:419-426) o directamente la subunidad A de la toxina de la difteria (DT-A) (Palmiter et al. (1987) Cell 50:435-443; Breitman et al. (1987) Science 238:1563-1565) .

Finalmente, también se ha informado de que bajo ciertas condiciones y para algunos marcadores puede ser posible degradar parcialmente la superficie de una célula para acceder a los marcadores intracelulares pero manteniendo la célula viva (Berghuis et al. (2004) Int J Dev Neurosci 22:533-43) .

En el caso de la separación por flujo, los indicadores fluorescentes se pueden utilizar para el aislamiento de células vivas. Aunque se han desarrollado instrumentos para la separación por citometría de flujo a alta velocidad que permiten la separación de algunas decenas de miles de células por segundo, sería un gran adelanto si se pudieran utilizar técnicas como la de separación magnética de células para el aislamiento de células o de entidades biológicas derivadas de éstas, caracterizadas por un marcador intracelular o con propiedades espacio-temporales. La separación inmunomagnética de células, por ejemplo, MACS Cell Separation System, permite separar varios miles de millones de células en pocos minutos, es mucho menos incómoda y con un coste mucho más eficaz que la citometría de flujo, ya que no son necesarios instrumentos complejos ni personal experto.

Para las líneas celulares y las células primarias que están cultivadas in vivo, se ha informado de varios procedimientos para la introducción de un marcador celular de superficie transgénico para posteriormente separar estas células utilizando la citometría de flujo o separación magnética de células (Gaines et al. (1999) Biotechniques 26:683-688) . En resumen, las células se transfectan con un constructo que conduce a la expresión de un marcador de superficie que puede ser dirigido a su vez por un anticuerpo específico que transporta una etiqueta fluorescente o una micoresfera superparamagnética. Este enfoque se puede extender también a la expresión de un marcador transgénico de superficie celular en las células de un organismo completo utilizando los procedimientos de transfección adecuados como vectores virales, inyección pronuclear o enfoques dirigidos al gen (Yasunaga et al. (2005) Nat. Biotech. 23:1542-1550) .

Sin embargo, un experto en la materia, no puede predecir si un organismo completo transgénico o transfectado va a expresar un indicador de la forma que se desea. Los transgénicos exógenos pueden no alojar todas las secuencias necesarias y suficientes para una regulación adecuada de la transcripción y puede por consiguiente recibir la influencia por, por ejemplo, de elementos cis-reguladores próximos al lugar de la inserción (Banares et al. (2005) Genesis 42:6-16) . Por consiguiente, la generación y la caracterización de por ejemplo, un ratón transgénico adecuado todavía resulta incómoda y requiere demasiado tiempo.

Por lo que se refiere a la naturaleza de los marcadores de superficie transgénicos, se han descrito en la bibliografía varias posibilidades distintas (ver anteriormente, por ejemplo, CD4, LNGFR, H2Kk, DTR) . La mayoría de estos marcadores son proteínas que aparecen de forma... [Seguir leyendo]

1. Célula que contiene un gen que no está presente en esta forma en un tipo salvaje de la célula, y que codifica un marcador de superficie extracelular transgénico condicional que es detectable sobre la superficie de la célula,

en la que el gen que codifica un marcador de superficie transgénico condicional comprende:

(i) un promotor para dirigir la transcripción de una primera secuencia de transcripción, enlazado funcionalmente a

(ii) una primera secuencia de transcripción para evitar la transcripción de una segunda secuencia de transcripción, y

(iii) una segunda secuencia de transcripción que codifica el marcador de superficie, que comprende 15

(a) un dominio de asociación de membrana o transmembrana para anclar el marcador de superficie en la membrana celular, y

(b) una segunda secuencia de etiqueta para tornar una célula clasificable,

de manera que la primera secuencia de transcripción es extraíble condicionalmente de forma que la segunda secuencia de transcripción puede ser transcrita, y

de manera que el marcador de superficie torna la célula clasificable a través de la detección del marcador 25 de superficie transgénico condicional sobre la superficie de la célula.

2. Célula según la reivindicación 1, en la que el marcador de superficie se expresa ectópicamente o es una forma modificada de una proteína que se expresa endógenamente, no cumpliendo la forma modificada la misma función que la proteína que se expresa endógenamente;

en la que la primera secuencia de transcripción se puede escindir mediante una reacción no enzimática o mediante una reacción enzimática;

en la que la primera secuencia de transcripción está flanqueada sobre cada lado por un sitio de reconocimiento 35 de recombinasa para la extracción condicional de la primera secuencia de transcripción del gen;

en la que la primera secuencia de transcripción es extraíble condicionalmente por una recombinasa, en particular por una recombinasa CRE o una recombinasa FLP; y/o en la que la segunda secuencia de transcripción es un gen de entre el grupo que consiste en LNGFR, CD4, H2Kk, CD133, CD271, CD4, H2Kk, CD2, CD14, CD90 o CD45 en una forma sin modificar o modificada.

3. Célula según la reivindicación 1 ó 2, en la que el promotor es un promotor de un gen de entre el grupo que contiene: actina, CAGGS, hCMV, PGK, FABP, Lck, CamKII, CD19, queratina, albúmina, aP2, insulina, MCK, MyHC, 45 WAP, Col2A, Mx, tet, Trex y ROSA26.

4. Constructo para la generación de una célula transgénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con un gen que codifica un marcador de superficie transgénico extracelular condicional que comprende

(i) un promotor para dirigir la transcripción de una primera secuencia de transcripción, enlazado funcionalmente a

(ii) una primera secuencia de transcripción para evitar la transcripción de una segunda secuencia de

transcripción, y 55

(iii) una segunda secuencia de transcripción que codifica un marcador de superficie extracelular, que comprende

(a) un dominio de asociación de membrana o transmembrana para anclar el marcador de superficie extracelular en la membrana celular, y

(b) una segunda secuencia de etiqueta para tornar una célula clasificable,

de manera que la primera secuencia de transcripción es extraíble condicionalmente de forma que la segunda secuencia de transcripción puede ser transcrita, y 65 de manera que el marcador de superficie extracelular torna la célula clasificable a través de la detección del marcador de superficie transgénico condicional sobre la superficie de la célula.

5. Constructo según la reivindicación 4, que comprende además una primera parte de secuencia aguas arriba del gen y una segunda secuencia génica aguas abajo del gen para la recombinación homóloga con una secuencia genómica, siendo opcionalmente, la primera parte de secuencia y la segunda parte de secuencia homólogas a las partes de secuencia correspondientes de la secuencia genómica.

6. Utilización ex vivo de un constructo según la reivindicación 4 ó 5, para la generación de una célula clasificable que contiene un gen que codifica un marcador de superficie extracelular transgénico condicional que es detectable 10 sobre la superficie de la célula.

7. Procedimiento ex vivo para generar una célula clasificable según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la introducción de un constructo según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5 en una célula.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, que comprende además la expresión de una recombinasa de manera constitutiva o inducible.

9. Procedimiento para la generación de un organismo transgénico no humano que comprende las etapas siguientes - introducir un constructo según las reivindicaciones 4 o 5 en una célula no humana, y

- propagar la célula bajo unas condiciones que permitan el desarrollo de un organismo.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la célula es una célula madre embrionaria no humana o una célula madre embrionaria como una célula adulta no humana reprogramada que se dispone en un blastocito no humano que se implanta en una madre de alquiler no humana.

11. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el constructo se introduce en el pronúcleo de un ovocito no humano que se implanta en una madre de alquiler no humana. 30

12. Procedimiento para la separación de una célula de una población de células, siendo la célula que se debe separar una célula según las reivindicaciones 1 a 3, y en el que el gen que codifica el marcador de superficie extracelular transgénico condicional no está contenido en otras células de la población, que comprende las etapas siguientes

- expresar el marcador de superficie extracelular transgénico condicional para tornar la célula clasificable a través de la detección del marcador de superficie extracelular transgénico condicional, y

-separar la célula de la población mediante el marcador de superficie extracelular transgénico condicional 40 expresado.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la separación se realiza añadiendo un anticuerpo a la población de células que se une específicamente al marcador de superficie extracelular transgénico condicional,

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el agente detectable es un agente sensible magnéticamente.

en el que el anticuerpo se marca opcionalmente con un agente detectable, tal como un colorante fluorescente o un agente sensible magnéticamente.

15. Procedimiento según la reivindicación 13, que comprende además las etapas siguientes

- inmovilizar la célula unida específicamente al anticuerpo etiquetado con un agente sensible magnéticamente en una matriz ferromagnética a través de un campo magnético,

-lavar la matriz para extraer las células no unidas, y

- extraer el campo magnético para eluir la célula de la matriz.