Procedimiento y dispositivo para la determinación de la función plaquetaria y de las condiciones de flujo.

Procedimiento para determinar la función plaquetaria en una muestra de sangre entera,

en donde elprocedimiento comprende los siguientes pasos:

a) Conducción de la sangre a través de un capilar y posteriormente a través de una abertura del elementoseparador y;

b) Medición del tiempo que se necesita para la formación de un coágulo de trombocitos en la abertura del elementoseparador hasta la obturación de la abertura;

caracterizado porque el elemento separador contiene

i) un activador de receptores de adenosina;

ii) un activador de adenil ciclasas intracelulares del grupo de la prostaglandina E1, forskolina, prostaglandina 12, ysus derivados estables iloprost y cicaprost; y

iii) iones de calcio.

Procedimiento y dispositivo para la determinación de la función plaquetaria y de las condiciones de flujo.

La presente invención se enmarca en el ámbito del diagnóstico de la función plaquetaria y hace referencia a un procedimiento in vitro para la determinación de la función plaquetaria en condiciones de flujo, así como también a un dispositivo para la realización del mencionado procedimiento. El procedimiento es particularmente adecuado para la determinación del efecto del clopidogrel después de la ingestión oral y de otros antagonistas antitrombóticos P2Y (12) más efectivos. Además, mediante el presente procedimiento puede comprobarse el bloqueo por antagonistas específicos del segundo receptor de ADP "adenosín difosfato" de los trombocitos (receptor P2Y (1) ) .

Los procesos fisiológicos que garantizan, por un lado, la fluidez de la sangre en el sistema vascular y por otro lado, mediante la formación de coágulos, aseguran la prevención de pérdidas de sangre extravasculares, se engloban en el concepto de hemostasis. En la regulación de la hemostasis participan una pluralidad de factores proteicos, así como también componentes celulares, como los trombocitos (plaquetas) . En el caso de una lesión vascular primero se presenta la incorporación de los trombocitos en el colágeno subendotelial. Este factor de adhesión se manifiesta mediante proteínas de adhesión como las del factor de von Willebrand (VWF) . Durante el proceso de adhesión los trombocitos se activan y desde sus gránulos vierten sustancias mediadoras que inducen a la agregación de otros trombocitos, así como a un reforzamiento de la propia activación plaquetaria. De esta manera, se genera una obstrucción primaria de las paredes vasculares (hemostasis primaria) , obstrucción que se estabiliza a través de otras reacciones del sistema coagulante plasmático (hemostasis secundaria) . Una regulación errónea de estos procesos pueden conducir a una propensión a la trombosis o a la hemorragia y según sea el grado de gravedad, pueden tener consecuencias fatales.

En el diagnóstico de la coagulación se realizan varias pruebas in vitro, las cuales colaboran en la determinación cualitativa de la coagulación de la sangre de un paciente o en la determinación de la existencia de alguna disfunción en la coagulación. En el caso de una disfunción en la coagulación a menudo es necesario obtener una información más precisa de la propia causa de la disfunción que se esté presentando, para así poder elegir las medidas terapéuticas más oportunas. Una fase importante de la función plaquetaria del sistema de coagulación que puede ser examinada puntualmente es la hemostasis primaria, la cual depende esencialmente de la capacidad funcional de los trombocitos.

Los procesos empleados para la determinación de la función plaquetaria no se utilizan solamente para el diagnóstico de alteraciones de la función de los trombocitos adquiridas o heredadas, sino también para el control de terapias antitrombóticas. Los medicamentos que inhiben la agregación plaquetaria se emplean principalmente para la profilaxis y terapia en sucesos tromboembólicos arteriales, como infarto de miocardio o apoplejía. Los principios activos más difundidos con efecto inhibidor de la agregación plaquetaria son el ácido acetilsalicílico (ASS) y las tienopiridinas, clopidogrel y ticlopidina. El ASS inhibe de forma irreversible la Ciclooxigenasa 1 (COX-1) , una enzima intracelular que participa de la síntesis del tromboxano A2, un estimulador de la agregación plaquetaria. El clopidogrel y la ticlopidina pertenecen, por su mecanismo de acción, a la clase de los antagonistas P2Y (12) . Tras la ingestión oral de clopidogrel o ticlopidina se forman metabolitos en el hígado que bloquean de forma selectiva el receptor P2Y (12. El receptor purinérgico P2Y (12) es expresado en la superficie de los trombocitos y se activa mediante el adenosín difosfato (ADP) extracelular. Como consecuencia de la activación del receptor P2Y (12) se ponen en marcha procesos intracelulares en los trombocitos, como por ejemplo, la inhibición de la formación de (AMPc) o adenosín monofosfato cíclico que provocan una reacción de agregación plaquetaria. Los antagonistas P2Y (12) bloquean los receptores P2Y (12) sobre la superficie de los trombocitos y por tanto, tienen un efecto antitrombótico.

El segundo receptor ADP purinérgico P2Y (1) también se expresa en la superficie de los trombocitos y se activa mediante el adenosín difosfato extracelular. Como consecuencia de la activación del receptor P2Y (1) se ponen en marcha procesos intracelulares en los trombocitos, (como por ejemplo, un incremento en el calcio intracelular) , que activan una reacción de agregación plaquetaria. Los antagonistas del receptor P2Y (1) contrarrestan por tanto este proceso y tienen un efecto antitrombótico.

Se considera cada vez más importante el conocimiento preciso del estado de la función plaquetaria de los pacientes que reciben una terapia antitrombótica dado que, por ejemplo, la aparición de la denominada resistencia al clopidogrel se considera como un factor de riesgo a ser tomado en cuenta seriamente. Una resistencia al clopidogrel se presenta cuando la función plaquetaria de un paciente no es influida por la administración de la dosis estándar de clopidogrel o lo es en grado mínimo. Mediante la determinación de la función plaquetaria se puede por un lado, comprobar si mediante la dosis escogida se logra un efecto antitrombótico suficiente. Por otro lado, se pueden comprobar y tratar dosis o efectos demasiado altos de un medicamento antitrombótico, lo que es muy importante por ejemplo, antes de intervenciones quirúrgicas, para excluir complicaciones por hemorragias.

Del estado de la técnica se conocen diferentes procesos para el análisis de la función plaquetaria. En el caso de la determinación del tiempo de sangría se trata de una prueba global in vivo que registra la hemostasis primaria. El tiempo de sangría se determina practicando a los pacientes una pequeña herida de incisión o pinchazo y midiendo el tiempo hasta la detención de la hemorragia. Se trata de una prueba informativa aproximada, difícil de estandarizar, la cual se utiliza sobre todo en situaciones de emergencia, para obtener una vista general de la hemostasis primaria. La toma de inhibidores de la agregación plaquetaria conlleva una prolongación del tiempo de sangría. Es desventajoso en la determinación del tiempo de sangría que, en el caso de un tiempo normal de sangría, no pueda descartarse que exista oculta una disfunción de la función plaquetaria.

Diversos procedimientos in vitro posibilitan una comprobación esencialmente más sensible de alteraciones de la función plaquetaria. En estos procedimientos se induce, usualmente mediante una prueba de sangre entera o en una prueba de plasma rico en plaquetas (PRP) , a la agregación plaquetaria mediante la administración de un activador. Los activadores más utilizados para la agregación plaquetaria son ADP (5'-adenosín difosfato) , colágeno, epinefrina (adrenalina) , ristocetina y diferentes combinaciones de ellos, así como trombina, TRAP (ThrombinReceptor-Activating-Protein, o proteína activadora de receptor de trombina) o serotonina.

En el caso de la agregometría por transmisión de luz, también denominada agregación plaquetaria por el método de Born, se mide la capacidad de agregación de los trombocitos en plasma rico en plaquetas de manera fotométrica en un agregómetro ante la presencia de sustancias que inducen la agregación. Mediante la formación de agregados aumenta la transmitancia luminosa del análisis PRP, de tal manera que mediante la medición de la transmitancia luminosa se puede determinar, por ejemplo la velocidad de la formación de agregados. Por medio de la agregometría por transmisión de luz se puede registrar también el efecto terapéutico de inhibidores de agregación plaquetaria empleados en forma medicamentosa. Una desventaja de la agregometría por transmisión de luz es que sólo se puede emplear plasma rico en plaquetas como material de muestra. Al plasma rico en plaquetas le faltan no sólo componentes importantes de la sangre, como por ejemplo, los glóbulos rojos y blancos, sino que además, se requiere de una preparación previa de la prueba que demanda mucho tiempo y es vulnerable a error.

BIN XU ET AL ("Acyclic Analogues of Adenosine Biphosphates as P2Y Receptor Antagonists: Phosphate Substitution Leads to Multiple Pathways of Inhibition of Platelet Aggregation" JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. WASHINGTON, US, Bd. 45, 2002, páginas 5694-5709) revela asimismo un método para la detección del efecto antitrombótico de un antagonista P2Y (1) , como por ejemplo, el MRS2395... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para determinar la función plaquetaria en una muestra de sangre entera, en donde el

procedimiento comprende los siguientes pasos: a) Conducción de la sangre a través de un capilar y posteriormente a través de una abertura del elemento separador y;

b) Medición del tiempo que se necesita para la formación de un coágulo de trombocitos en la abertura del elemento separador hasta la obturación de la abertura; caracterizado porque el elemento separador contiene

i) un activador de receptores de adenosina; ii) un activador de adenil ciclasas intracelulares del grupo de la prostaglandina E1, forskolina, prostaglandina 12, y sus derivados estables iloprost y cicaprost; y

iii) iones de calcio

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1 caracterizado porque el elemento separador utilizado contiene un activador de receptores de adenosina del grupo de 5’-difosfato de adenosina, 2-metiltio-adenosina-5'-difosfato.

3. Procedimiento conforme a la invención conforme a una de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado porque la muestra de sangre entera es anticoagulada con un inhibidor directo de la trombina.

4. Procedimiento conforme a la invención conforme a una de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado porque la muestra de sangre entera es anticoagulada con un inhibidor directo de factor Xa .

5. Procedimiento conforme a la invención conforme a una de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado porque la muestra de sangre entera es anticoagulada con citrato.

6. Utilización de un procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5 para la determinación del efecto antitrombótico de un antagonista P2Y (12) .

7. Utilización conforme a la reivindicación 6 para la determinación del efecto antitrombótico de un antagonista P2Y (12) del grupo de clopidogrel, ticlopidina, prasugrel, AR-C67085MX, cangrelor, C1330-7 MRS2395 y 5'monofosfato de 2-metiltioadenosina.

8. Utilización de un procedimiento conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5 para la determinación del efecto antitrombótico de un antagonista P2Y (1) .

9. Utilización conforme a la reivindicación 8 para la determinación del efecto antitrombótico de un antagonista P2Y (1) del grupo de MRS 2179, MRS 2279, MRS 2500, A2P5P, A3P5P y A3P5PS.

10. Dispositivo para la determinación de la función plaquetaria en una muestra de sangre entera, en donde el dispositivo comprende los siguientes elementos: a) Una cámara de depósito para alojar la muestra;

b) Un capilar a través del cual la sangre es conducida desde la cámara de depósito a una celda de medición; c) Una celda de medición, la cual está subdividida mediante un elemento separador en dos compartimentos, en donde el primer compartimento recibe la sangre del capilar;

d) Un elemento separador que subdivide la celda de medición en dos compartimentos y que presenta una abertura a través de la cual la sangre puede fluir desde el primer compartimento al segundo compartimento; caracterizado porque el elemento separador contiene i) un activador de receptores de adenosina;

ii) un activador de adenilciclasas intracelulares del grupo de la prostaglandina E1, forskolina, prostaglandina 12, y sus derivados estables iloprost y cicaprost; y

iii) iones de calcio 11. Utilización de un dispositivo conforme a la reivindicación 10 en un procedimiento para la determinación de la 5 función plaquetaria.

12. Utilización de un dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 10 y 11 en un procedimiento para la determinación del efecto antitrombótico de un antagonista P2Y (12) .

13. Utilización de un dispositivo conforme a una de las reivindicaciones 10 y 11 en un procedimiento para la determinación del efecto antitrombótico de un antagonista P2Y (1) .

FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA 3