Procedimiento para la determinación de infecciones por Trichinella.

Procedimiento para la determinación de infecciones por Trichinella en un animal o el ser humano,

que comprendela incubación con antígenos de Trichinella de una muestra de tejido tomada del animal o del ser humano, eltratamiento de la muestra de tejido, la adición de anti-anticuerpos a la muestra de tejido y la verificación de si hatenido lugar una unión de los anti-anticuerpos a eventuales complejos antígeno-anticuerpos contenidos en la muestrade tejido, caracterizado porque como anti-anticuerpos se añaden al mismo tiempo anticuerpos anti-IgG y anticuerposanti-IgM.

Procedimiento para la determinación de infecciones por Trichinella

La invención se refiere a un procedimiento para la determinación de infecciones por Trichinella según el preámbulo de la reivindicación 1.

Trichinella spp. comprende un grupo de nematodos que aparecen en todo el mundo. Las especies que predominan en Europa son Trichinella spiralis, Trichinella britovi, Trichinella pseudospiralis y Trichinella nativa. Las infecciones por Trichinella pueden aparecer en diferentes especies, incluido el hombre, cerdos, ratas, osos, caballos y aves, por mencionar sólo algunos ejemplos.

En el caso de Trichinella se trata de nematodos parásitos que recorren un ciclo vital definido. Las larvas son ingeridas por el consumo de carne cruda o insuficientemente cocida. Después del consumo, son liberadas por los jugos gástricos desde donde acceden al tracto intestinal. Aquí se desarrollan para formar nematodos adultos. Después del apareamiento, las hembras paren hasta 1500 nuevas larvas que, a través de la linfa y del torrente sanguíneo, acceden al tejido muscular estriado, en particular el diafragma, lengua, ojos y músculos masticatorios. Las larvas se desarrollan y forman complejos de larvas que calcifican en el transcurso del tiempo.

Las infecciones por Trichinella representan un gran problema en la cría de animales. Debe excluirse con seguridad el hecho de que los seres humanos, después de consumir carne cruda o no suficientemente cocida de animales enfermos, enfermen de triquinelosis. La triquinelosis humana es una enfermedad grave que provoca considerables dolencias y que, en casos extremos, conduce a la muerte.

Por lo tanto, con el fin de la seguridad en los alimentos, p. ej. todas las canales de cerdo deben ser testadas como parte de un examen post-mortem. Por norma general, las canales continúan siendo elaboradas inmediatamente después de la matanza. Lo problemático en ensayos habituales es que el descuartizado en instalaciones de descuartizado previstas a continuación del matadero ya ha sido concluido en una determinada parte antes de que se disponga de los resultados de los ensayos de Trichinella. Esto representa un problema logístico considerable. En caso de duda, en el supuesto de resultados positivos, las piezas descuartizadas del cerdo deben ser seleccionadas del circuito de tratamiento y destruidas.

Actualmente están permitidos procedimientos en los que la Trichinella es detectada de forma directa. Un método antiguo en Europa, admitido ya sólo durante un período de transición, es la denominada triquinoscopia, en la que tejido es comprimido entre dos placas de vidrio y luego es examinado al microscopio. Este procedimiento es ciertamente poco sensible y, además, laborioso y costoso. Además, especies de Trichinella que no se encapsulan tales como, p. ej., Trichinella pseudospiralis, no son descubiertas o sólo lo son con mucha dificultad.

Otro método admitido es el denominado ensayo de digestión que es más sensible que la detección directa previamente descrita. En el caso de este ensayo, el tejido muscular que rodea a la larva es digerido artificialmente con proteasas y ácido clorhídrico y, después de diferentes etapas de sedimentación, quedan al descubierto las larvas. A continuación, se puede determinar al microscopio el número de larvas. El límite de detección se encuentra en 3 a 5 larvas por gramo de tejido.

Esencialmente más rápidos y con una sensibilidad claramente superior se encuentran procedimientos serológicos conformes al género expuesto en los que la mayoría de las veces se detectan de un modo indirecto anticuerpos contra Trichinella spp. Procedimientos serológicos de este tipo pueden llevarse a cabo, por ejemplo, en el suero sanguíneo o en el jugo de carne. Procedimientos habituales tienen un límite de detección de 0, 01 larvas por gramo de tejido muscular.

En el caso de procedimientos serológicos conformes al género expuesto, p. ej. muestras de suero procedentes del organismo a examinar, son mezcladas con antígenos de Trichinella, p. ej. el antígeno excretor/secretor (E/S) . Eventuales anticuerpos contenidos en el suero en virtud de la presencia de una infección por Trichinella se unen al antígeno. Los anticuerpos ligados son detectados, por su parte, por ejemplo con anticuerpos anti-IgG de cerdo marcados. Procedimientos serológicos habituales trabajan, p. ej., con antígenos inmovilizados y detectan anticuerpos IgG eventualmente ligados. Antígenos especiales adicionales para procedimientos serológicos se dan a conocer, p. ej., en el documento WO 2007/090960.

Reiterova K. et al., (Infection 35 (2) ; 2007; págs. 89-93) da a conocer la determinación de una infección por Trichinella, que comprende la incubación de suero del paciente con antígeno E/S acoplado a placas ELISA, y determinación de IgG e IgM por medio de anti-anticuerpos correspondientes (resumen) .

A pesar de que procesos serológicos conformes al género expuesto son muy sensibles, por el momento no están todavía admitidos para la inspección de carne o en programas de seguridad de alimentos. Ciertamente los procesos serológicos son más rápidos y más sensibles que los ensayos directos tales como, p. ej., la digestión artificial, pero las actuales Normas de la UE no permiten, sin embargo, ningún ensayo individual de canales con procesos serológicos, dado que los procesos serológicos conocidos pueden proporcionar resultados falsos negativos, en particular en la fase temprana de la infección. Una postura similar la adopta la Comisión Internacional de Triquinelosis (CIT) . También en este caso, se critica el que la ventana diagnóstica para métodos serológicos no es suficiente y no se pasan por alto eventuales animales positivos con los métodos de los que se dispone en virtud de la señal demasiado baja en la fase de infección temprana. Sin embargo, dado que también en esta fase las larvas se encuentran ya en la musculatura y, con ello, pueden ser infecciosas, también los animales deben ser identificados con seguridad en la fase de infección temprana.

Misión de la presente invención es habilitar un proceso serológico seguro para el diagnóstico de infecciones por Trichinella con el que se puedan detectar tanto infecciones tempranas como también infecciones avanzadas por Trichinella.

El problema se resuelve con un procedimiento según la reivindicación 1. Ejecuciones ventajosas están indicadas en las reivindicaciones subordinadas.

El procedimiento de acuerdo con la invención funciona esencialmente tal como se ha indicado antes. Una muestra del hombre o animal a examinar, p. ej. suero o jugo de carne, se incuba con antígenos preferiblemente inmovilizados. Anticuerpos contenidos eventualmente en la muestra se fijan a los antígenos. Los complejos anticuerpo-antígeno se detectan entonces con anticuerpos marcados. En tal caso, puede tratarse, en particular, de procesos ELISA. Sin embargo, también son imaginables otros procedimientos con otras marcaciones que puedan ser detectadas, p. ej., ópticamente.

Tal como ya se ha indicado antes, los ensayos habituales de Trichinella detectan los complejos de anticuerpoantígeno con anticuerpos contra anticuerpos IgG, dado que estos son los anticuerpos persistentes que habitualmente se forman de manera creciente en el transcurso de la infección.

Conforme a la invención, se prevé entonces que, además, se examine simultáneamente si se formaron anticuerpos IgM. Esto puede tener lugar de una manera sencilla mediante la adición de anticuerpos contra anticuerpos IgM.

De acuerdo con la invención, se prevé, por lo tanto, examinar la muestra en cuanto a la presencia de anticuerpos IgM e IgG en combinación. En la fase temprana de la infección se forman predominantemente anticuerpos IgM, mientras que el contenido en anticuerpos IgG comienza sólo a partir del 15º día después de la infección. El contenido en anticuerpos IgM empieza a disminuir de nuevo aproximadamente en este instante.

La disminución en el contenido en anticuerpos IgM a observar relativamente pronto después de la infección, es también un motivo esencial de por qué, p. ej. procesos ELISA con los que se determinan anticuerpos IgM, no sean considerados adecuados para el diagnóstico de infecciones por Trichinella. Para ello se remite de manera representativa a una tesis doctoral llevada a cabo en el “Instituto para Parasitología” en Varsovia, Polonia, con el título “The usefulness of ELISA test for early serological detection of Trichinella spp. infection in pigs”, el cual se presentó en el marco de un debate en 2006. En la tesis doctoral se confrontaron métodos en los que se detectaron, por una parte, anticuerpos IgG y, por otra parte, anticuerpos IgM. En el marco de esta... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la determinación de infecciones por Trichinella en un animal o el ser humano, que comprende la incubación con antígenos de Trichinella de una muestra de tejido tomada del animal o del ser humano, el

tratamiento de la muestra de tejido, la adición de anti-anticuerpos a la muestra de tejido y la verificación de si ha tenido lugar una unión de los anti-anticuerpos a eventuales complejos antígeno-anticuerpos contenidos en la muestra de tejido, caracterizado porque como anti-anticuerpos se añaden al mismo tiempo anticuerpos anti-IgG y anticuerpos anti-IgM.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como antígeno se emplea antígeno de E/S de Trichinella.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los antígenos empleados se presentan en forma inmovilizada.

1.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se emplean anti-anticuerpos marcados.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se provee a anticuerpos anti20 IgG de una marcación distinta a la de los anticuerpos anti-IgM.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la muestra de tejido es suero, plasma o jugo de carne.