Inhibición de la interación entre hif-1a y p300/cbp con hélices basadas en sustitutos de los enlaces de hidrógeno.

Un péptido de la Fórmula (I) que tiene una o más α-hélices estables,

internamente restringidas:**Fórmula**

en donde

R1 es un aminoácido, un péptido, -OR4, -CH2NH2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno,

R4 es alquilo o arilo; o

R1 tiene la fórmula:**Fórmula**

en donde A5 es un péptido, un residuo de aminoácido, un grupo acilo, o hidrógeno; y

cada R5 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo;

es un enlace sencillo carbono-carbono o un enlace doble carbono-carbono que puede ser cis o trans;

cada n es independientemente 1 o 2;

R2 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo;

m es cualquier entero positivo;

A3 es **Fórmula**

en donde R9 es una cadena lateral de aminoácido;

(i) A1 es Thr; A2 es Ser o Ala; A3 es Tyr o Ala; y A4 comprende la fórmula X1X2X3X4X5X6X7, en donde X1 es Asp o Asn,X2 es Val, Cys, o Ala, X3 es Glu o Gln, X4 es Val o Tyr, X5 es Asn o Arg, X6 es Ala, y X7 es Arg o está ausente;o

(ii) A1 y A2 son independientemente Glu o Gln; A3 es Leu; y A4comprende la fórmula LRX8LX9, donde L es Leu, R esArg, X8 es Ala o Tyr, y X9 es Asp o Asn; y

R3 es un péptido, -OR6, -N(R7)2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, en donde R6 es un grupo alquilo o un grupoarilo, y cada R7 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo; yen donde el péptido modula la interacción entre entre C-TAD de HIF-1α y el dominio CH1 de p300/CBP.

Inhibición de la interación entre hif-1a y p300/cbp con hélices basadas en sustitutos de los enlaces de hidrógeno

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El papel de las interacciones del Coactivador HIF-1a- en la regulación de la transcripción de VEGF

La interacción entre el dominio 1 rico en cisteína-histidina ("CH1") de la proteína coactivadora p300 (o la proteína de unión homóloga CREB, CBP) y el dominio de transactivación C-terminal ("C-TAD, " aa 786-826 de número de acceso NCBI NP 001521) del factor 1a inducible por hipoxia ("HIF-1a") (Freedman y otros, "Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1a, " Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 99:5367-72 (2002) ; Dames y otros, "Structural Basis for HIF-1a/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response, "Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002) ) media la transactivación de genes inducibles por hipoxia (Hirota & Semenza, "Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1, " Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006) ; Semenza, "Targeting HIF-1 for Cancer Therapy, " Nat. Rev. Cancer 3:721-32 (2003) ) . Los genes inducibles por hipoxia son importantes contribuyentes en la angiogénesis y metástasis de cáncer, como se muestra en las Figuras 1A-C (Orourke y otros, "Identification of Hypoxically Inducible mRNAs in HeLa Cells Using Differential-display PCR, " Eu. J Biochem. 241 :403-10 (1996) ; Ivan y otros, "HIFa Targeted for VHL-mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing, " Science 292:464-8 (2001) ) . Bajo normoxia, la subunidad a de HIF-1 se hidroxila sucesivamente en los residuos de prolina 402 y 564 por prolina hidroxilasas, se une a ubiquitina, y después se degrada por el sistema ubiquitina-proteosoma, como se muestra en la Figura 2. Este proceso, mediado por la proteína supresora de tumor von Hippel-Lindau (Kaelin, "Molecular Basis of the VHL Hereditar y Cancer Syndrome, " Nat. Rev. Cancer 2:673-82 (2002) ) , es responsable de controlar los niveles de HIF-1a y, como resultado, la respuesta transcripcional a la hipoxia (Maxwell y otros, "The Tumour Suppressor Protein VHL Targets Hypoxia-inducible Factors for Oxygen-dependent Proteolysis, " Nature 399:271-5 (1999) ) . Bajo condiciones hipóxicas, HIF-1a ya no es objeto de la destrucción y se acumula. La heterodimerización con su socio de unión expresado constitutivamente, el translocador nuclear del receptor de aril hidrocarburo ("ARNT") (Wood y otros, "The Role of the aril Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) in Hypoxic Induction of Gene Expression, " J Biol. Chem. 271: 15117-23 (1996) ) resulta en la unión a un elemento de respuesta a la hipoxia cognado ("HRE") (Forsythe y otros, "Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1, " Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996) ) . Un tercer sitio de hidroxilación regulatoria en asparagina 803 se inhibe también bajo condiciones hipóxicas (Lando y otros, "FIH-I is an Asparaginyl Hydroxylase Enzyme That Regulates the Transcriptional Activity of Hypoxia-inducible Factor, " Genes & Develop. 16:1466-71 (2002) ) , lo que permite el reclutamiento de coactivadores de p300/CBP, que disparan la sobreexpresión de genes inducibles por hipoxia, como se muestra en la Figura 2. Entre estos genes que codifican los péptidos angiogénicos tales como el factor de crecimiento vascular endotelial ("VEGF") y los receptores de VEGF VEGFR-I (Flt-1) y VEGFR-2 (KDR/Flk-1) , así como también las proteínas involucradas en el metabolismo energético alterado, tal como los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3, y hexoquinasas 1 y 2 (Forsythe y otros, "Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxiainducible Factor 1, " Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996) ; Okino y otros, "Hypoxia-inducible Mammalian Gene Expression Analyzed in Vivo at a TATA-driven Promoter and at an Initiator-driven Promoter, " J Biol. Chem. 273:23837-43 (1998) ) .

Metabolitos fúngicos de epiditiodicetopiperazina como reguladores de la transcripción inducible por hipoxia

Debido a que la interacción del C-TAD de HIF-1a con el coactivador transcripcional p300/CBP es un punto de amplificación significativa en la respuesta transcripcional, su ruptura con los ligandos proteicos diseñados podría ser un medio efectivo de supresión de la glicólisis aeróbica y angiogénesis (es decir, la formación de nuevos vasos sanguíneos) en cánceres (Hirota & Semenza, "Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1, " Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006) ; Ramanathan y otros, "Perturbational Profiling of a Cell-line Model of Tumorigenesis by Using Metabolic Measurements, " Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 102:5992-7 (2005) ; Underiner y otros, "Development of factor de crecimiento vascular endotelial Receptor (VEGFR) Kinase Inhibitors as Anti-angiogenic Agents in Cancer Therapy, " Curr. Med. Chem. 11:73145 (2004) ) . Aunque la superficie de contacto del C-TAD de HIF-1a con p300/CBP es extensa (3393 Å2) la inhibición de esta interacción proteína-proteína puede no requerir interferencia directa. En lugar de ello, la inducción de un cambio estructural a una de las parejas de unión (p300/CBP) puede ser suficiente para interrumpir el complejo (Kung y otros, "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway, " Cancer Cell 6:33-43 (2004) ) .

Aunque en el pasado se demostró que era difícil la inhibición de las interacciones nucleares proteína-proteína con pequeñas moléculas (Arkin & Wells, "Small-molecule Inhibitors of Protein-Protein Interactions: Progressing Towards the Dream, " Nat. Rev. Drug Discov. 3:301-17 (2004) ) , selecciones recientes de ligandos de proteínas de alta afinidad han resultado en varios logros notables (Kung y otros, "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway, " Cancer Cell 6:33-43 (2004) ; Issaeva y otros, "Small Molecule RITA Binds a p53, Blocks p53-HDM-2 Interaction and Activates p53 Function in Tumors, " Nat. Med. 10: 1321-8 (2004) ; Lepourcelet y otros, "Small-molecule Antagonists of the

Oncogenic Tcf/º-Catenin Protein Complex, " Cancer Cell 5:91-102 (2004) ; Vassilev y otros, "In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2, " Science 303:844-8 (2004) ; Grasberger y otros, "Discover y and Cocr y stal Structure of Benzodiazepinedione HDM2 Antagonists That Activate p53 in Cells, " J Med. Chem. 48:909-12 (2005) ;Ding y otros, "Structure-based Design of Potent Non-peptide MDM2 Inhibitors, " J Am. Chem. Soc. 127:10130-1 (2005) ; Berg y otros, "Small-molecule Antagonists of Myc/Max Dimerization Inhibit Myc-induced Transformation of Chicken Embr y o Fibroblasts, "Proc. Nat'l Acad. Sci. Estados Unidos 99:3830-5 (2002) ; Publicación Internacional de la patente núm. WO 2006/066775 de De Munari y otros) . Dos moléculas pequeñas, caetocina 1 (Hauser y otros, "Isolation and Structure Elucidation of Chaetocin, " Helv. Chirn. Acta 53 (5) :1061-73 (1970) ) (mostradas en la Figura 3A) y quetomina 2 (Waksman & Bugie, "Chaetomin, a New Antibiotic Substance Produced by Chaetomium Cochliodes I. Formation and Properties, " J. Bacteriol. 48:527-30 (1944) ) (mostrado en la Figura 3B) , han demostrado inhibir la interacción entre el C-TAD de HIF-1a y p300/CBP y atenuar la transcripción inducible por hipoxia, aunque el mecanismo exacto de esta inhibición no está claro (Kung y otros, "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway, " Cancer Cell 6:33-43 (2004) ) . A pesar de informes iniciales alentadores, se necesita fomentar el diseño de inhibidores de la vía HIF1, porque ambos 1 y 2 han inducido la necrosis coagulativa, anemia, y leucocitosis en animales de experimento. Podría ser deseable identificar otros inhibidores de la vía HIF-1 que carezcan o tengan efectos colaterales disminuidos. Chapman y otros, Organic Letters, 5825-5828 (2006) describe la síntesis en fase sólida asistida por microondas de a-hélices basadas en sustitutos de los enlaces de hidrógeno y análogos por metatesis con cierre de anillo. La solicitud de patente japonesa 2008096423 describe un método para determinar cuantitativamente una unión entre un péptido HIF-1aC-terminal marcada con una sustancia fluorescente y una CBP o proteína P300 y un método de selección. La solicitud de patente de Estados Unidos 2006/014675A1 se relaciona con un método para preparar un péptido que tiene una alfa-hélice estable, restringida internamente, hoja beta/giro beta, región helicoidal 310, o helicoidal pi y que estabilizan tales estructuras dentro de una estructura peptídica. Henchey y otros, Current Opinion in Chemical Biolog, 692-697 (2008) revisa estrategias para la estabilización de péptidos en... [Seguir leyendo]

1. Un péptido de la Fórmula (I) que tiene una o más a-hélices estables, internamente restringidas:

en donde R1 es un aminoácido, un péptido, -OR4, -CH2NH2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, R4 es alquilo o arilo; o R1 tiene la fórmula:

en donde A5 es un péptido, un residuo de aminoácido, un grupo acilo, o hidrógeno; y 15 cada R5 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo;

es un enlace sencillo carbono-carbono o un enlace doble carbono-carbono que puede ser cis o trans; cada n es independientemente 1 o 2; R2 es hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo; m es cualquier entero positivo; 20 A3 es en donde R9 es una cadena lateral de aminoácido;

(i) A1 es Thr; A2 es Ser o Ala; A3 es Tyr o Ala; y A4 comprende la fórmula X1X2X3X4X5X6X7, en donde X1 es Asp o Asn,

X2 es Val, Cys, o Ala, X3 es Glu o Gln, X4 es Val o Tyr, X5 es Asn o Arg, X6 es Ala, y X7 es Arg o está ausente; o (ii) A1 y A2 son independientemente Glu o Gln; A3 es Leu; y A4comprende la fórmula LRX8LX9, donde L es Leu, R es 30 Arg, X8 es Ala o Tyr, y X9 es Asp o Asn; y

R3 es un péptido, -OR6, -N (R7) 2, un grupo alquilo, un grupo arilo, o hidrógeno, en donde R6 es un grupo alquilo o un grupo arilo, y cada R7 es independientemente una cadena lateral de aminoácido, hidrógeno, un grupo alquilo, o un grupo arilo; y en donde el péptido modula la interacción entre entre C-TAD de HIF-1a y el dominio CH1 de p300/CBP.

2. Un péptido como se reivindica en la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en: y

en donde m y n son independientemente 1 o 2; y X is hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, un grupo alquilo, o un grupo arilo.

3. Un péptido como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2, que imita al menos los residuo.

79. 804 o 20 residuo.

81. 823 del dominio de transactivación C-terminal del Factor 1a inducible por hipoxia.

4. Una composición farmacéutica que comprende un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para usar en la reducción de la transcripción de un gen en una célula, en donde la transcripción del gen es mediada por la interacción del Factor 1a inducible por hipoxia con la proteína de unión a CREB y/o p300.

6. El péptido para usar como se reivindica en la reivindicación 5, en donde el gen se selecciona del grupo que consiste en adenilato quinasa 3, aldolasa A, aldolasa C, enolasa 1, transportador de glucosa 1, transportador de glucosa 3, gliceraldehído-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa 1, hexoquinasa 2, factor de crecimiento tipo insulina 2, proteína de unión a IGF 1, proteína de unión a IGF 3, lactato dehidrogenasa A, fosfoglicerato quinasa 1, piruvato quinasa M, p21, factor de crecimiento transformante 3, ceruloplasmina, eritropoyetina, transferrina, receptor de transferrina, receptor adrenérgico a1B, adrenomedulina, endotelina-1, hemo oxigenasa 1, óxido nítrico sintasa 2, inhibidor 1 del activador de plasminógeno, factor de crecimiento vascular endotelial, factor de crecimiento vascular endotelial, receptor FLT-1, factor de crecimiento vascular endotelial, receptor KDR/Flk-1, y p35srg.

7. Un peptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para usar para tratar o prevenir, en un sujeto que lo necesita, un trastorno mediado por interacción del Factor 1a inducible por hipoxia con la proteína de unión a CREB y/o p300.

8. Un péptido para usar como se reivindica en la reivindicación 7, en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste de isquemia de la retina, hipertensión pulmonar, retardo del crecimiento uterino, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, y cáncer.

9. Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para usar en la reducción o prevención de la 15 angiogénesis en un tejido.

10. Un péptido para su uso como se reivindica en la reivindicación 9, para usar in vivo.

11. Un péptido para usar como se reivindica en la reivindicación 9, en donde el tejido es un tumor.

12. Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para inducir apoptosis en una célula.

13. Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para disminuir la supervivencia y/o proliferación de una célula.

14. Un péptido para usar como se reivindica en la reivindicación 13, en donde la célula es cancerosa o está contenida en la vasculatura endotelial de un tejido que contiene células cancerosas.

15. Un péptido como se reivindica en las reivindicaciones 1, 2 o 3, para usar en la identificación de un ligando potencial 30 de la proteína de unión a CREB y/o p300.

16. Un péptido como se reivindica en la reivindicación 2, en donde m y n son 1, o m es 1 y n es 2, o m es 2 y n e 1, o ambos m yn son 2.