Genes de inositol polifosfato 2-quinasa y sus usos.

Un polinucleótido vegetal aislado que codifica para una inositol polifosfato 2-quinasa,

polinucleótido que codificaun polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2.

Genes de inositol polifosfato 2-quinasa y sus usos.

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas. Específicamente, la presente invención se refiere a la identificación y al uso de genes que codifican la enzima inositol polifosfato 2-quinasa (IPP2-K) , que está implicada en el mecanismo de biosíntesis de ácido fítico en plantas, y al uso de dichos genes y sus mutantes para reducir los niveles de ácido fítico, y/o para aumentar los niveles de fósforo no incluido en ácido fítico en semillas de plantas y comida o piensos que contengan dicha semilla.

El papel del fósforo en la nutrición animal es bien conocido. El ochenta por ciento del fósforo del organismo de los animales se encuentra en el esqueleto, proporcionando estructura al animal. El veinte por ciento del fósforo presente en animales puede encontrarse en tejidos blandos, donde está implicado en una miríada de reacciones bioquímicas que incluyen la síntesis y la actividad de ADN, ARN, fosfolípidos y algunas vitaminas B.

Aunque el fósforo es crítico para la salud del animal, no todo el fósforo presente en el alimento está biodisponible. El 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexa-kis-fosfato de mio-inositol, conocido comúnmente como ácido fítico, es una molécula abundante en muchas semillas de plantas y tejidos vegetales tales como raíces y tubérculos. Las sales de ácido fítico (o fitatos) son la forma principal de almacenamiento de fósforo en semillas, representando típicamente entre el 65% y el 80% del fósforo total (P) de las semillas. Cuando los no rumiantes consumen dietas basadas en semillas, el ácido fítico consumido forma sales de varios minerales nutricionalmente importantes en el tracto digestivo. La excreción de dichas sales reduce la retención y la utilización (es decir, la biodisponibilidad) tanto del fósforo como de los minerales. Por consiguiente, esto da como resultado una deficiencia de minerales tanto en humanos como en animales alimentados con estas semillas. Además, el fósforo ligado a ácido fítico en los residuos de animales contribuye a la contaminación de aguas superficiales y subterráneas.

Se han propuesto varias estrategias para reducir el impacto negativo que tiene en la dieta, en la retención de fósforo y minerales y en el medio ambiente, el contenido en ácido fítico de las semillas. Las estrategias incluyen la eliminación del ácido fítico de la dieta mediante una intervención post-recolección y reducir genéticamente el contenido en ácido fítico. Semillas con un contenido reducido de ácido fítico son reivindicadas en la patente US

5.689.054 (maíz) y en la patente US 6.111.168 (soja) . La alteración de los niveles de fitato mediante manipulación de mio-inositol 1-fosfato sintasa se discute en los documentos WO 00/73473, WO 99/05298, US 6.197.561 y US

6.291.224. La alteración de los niveles de fitato mediante desplazamiento en ononitol con inositol metil transferasa se discute en WO 99/37786. La patente US 6.197.561 propone cambiar los niveles de fitato a través de la alteración de una serie de enzimas adicionales, que incluyen fosfatidilinositol-3-quinasa, mio-inositol 1, 3, 4-trifosfato 5/6quinasa, mio-inositol monofosfatasa-3, inositol polifosfato 5-fosfatasa, D-mio-inositol-3-fosfato sintasa, D-mio-inositol trifosfato 3-quinasa, transportador de mio-inositol, fitasa de maíz, proteína de transferencia de fosfatidilinositol, fosfatidiloinositol-4-fosfato-5-quinasa, fosfolipasa específica de fosfatidilinositol, mio-inositol monofosfatasa-1, fosfatidilinositol 4-quinasa, fosfatidilinositol (4, 5) bis-fosfato 5-fosfatasa, fosfatidilinositol sintasa. La expresión de plantas/semillas de fitasa, una enzima capaz de degradar fitatos, también se describe en las patentes US 6.399.861, US 6.303.766, US 5.994.628, US 5.714.474 y US 5.543.576. La patente US 2003/0009011 (WO 02/059324) describe genes de inositol polifosfato quinasa y su uso para modular los niveles de fitato, y adicionalmente proporciona las secuencias de consenso para identificar otros genes de inositol polifosfato quinasa. La patente US 2003/0079247 (WO 03/027243) describe genes adicionales de inositol polifosfato quinasa descritos como la familia de genes de inositol 1, 3, 4-trifosfato 5/6 quinasa. El mutante Ipa2 descrito en el documento US 5.689.054 contiene una mutación en un miembro de esta familia de genes (véase también Plant Physiol. 2003 Feb; 131 (2) : 507-15) .

El documento US2004/0034888 describe una serie de secuencias de polinucleótidos vegetales. No se especifica ninguna utilidad particular para cada una de las secuencias incluidas.

Shi et al. (Plant Physiology, 2003, 131, 507-515) indican que un mutante de maíz particular bajo en ácido fítico se obtiene a través de una mutación en un gen de inositol fosfato quinasa.

Verbsky et al (J. Biol. Chem. 2002, 27, 35, 31857-31862) describen una secuencia de ADN genómico humano que codifica inositol 1, 3, 4, 5, 6-pentakis fosfato 2-quinasa humana.

A pesar de las anteriores estrategias, todavía existe una necesidad por mejorar el contenido nutricional de plantas, particularmente maíz, a través de la reducción de los niveles de ácido fítico y del aumento de los niveles de fósforo no incluido en ácido fítico.

La enzima IPP2-K cataliza múltiples etapas que conducen a la formación de ácido fítico. Por ejemplo, cataliza las reacciones de ATP + inositol 1, 4, 5, 6-tetrakisfosfato → ADP + inositol pentakisfosfato, y ATP + inositol 1, 3, 4, 5, 6pentakisfosfato → ADP + inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6-hexafosfato. Adicionalmente, esta enzima cataliza las reacciones de ATP + inositol 1, 4, 6-trifosfato → ADP + inositol 1, 2, 6-trifosfato. Una reducción de la actividad de la enzima IPP2-K en semillas vegetales en desarrollo interrumpiría la síntesis de ácido fítico, reduciendo con ello el nivel de ácido fítico en las semillas y haciendo que el fósforo estuviera más disponible metabólicamente para animales a los que se alimenta con la semilla. La presente invención aborda la necesidad de mejorar la biodisponibilidad de fosfato proporcionando secuencias de ácido nucleico que codifican toda la enzima IPP2-K, o una porción de la misma, y las herramientas para la manipulación del mecanismo biosintético de ácido fítico en las células vegetales.

Según la presente invención, se proporciona un polinucleótido vegetal aislado que codifica para una inositol polifosfato 2-quinasa, polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2.

La invención también se refiere a una proteína vegetal aislada de inositol polifosfato 2-quinasa que comprende un polipéptido que tiene la secuencia establecida en la SEC ID Nº: 2.

Otro aspecto adicional de la presente invención es un método para identificar un tejido vegetal que comprende una lesión en un gen que codifica una inositol polifosfato 2-quinasa de la presente invención, que comprende: someter a un tejido vegetal a mutagénesis; obtener una muestra de ADN del tejido vegetal sometido a mutagénesis o de sus descendientes; y ensayar la muestra de ADN para la lesión en el gen que codifica inositol polifosfato 2-quinasa.

Además, la presente invención se refiere a una semilla de maíz que contiene una lesión inducida artificialmente en un gen que codifica una inositol polifosfato 2-quinasa de la presente invención, donde la lesión afecta a la actividad del gen que codifica la inositol polifosfato 2-quinasa y en donde la lesión inducida artificialmente es un bloqueo de gen.

En otra realización adicional, la presente invención está dirigida a un método para disminuir el nivel de ácido fítico en un pienso para animales, que comprende: producir un pienso para animales a partir de plantas que contienen una lesión en un gen que codifica una inositol polifosfato 2-quinasa según la presente invención, en donde el pienso para animales tiene un nivel reducido de fitato.

La presente invención también se refiere a un método para disminuir el nivel de fósforo en un residuo animal que comprende: proporcionar pienso para animales procedente de una planta que incluye una lesión en un gen que codifica una inositol polifosfato 2-quinasa según la presente invención.

Además, la presente invención abarca una semilla mutante no letal de una especie de planta cereal que se caracteriza por un bajo contenido en ácido fítico respecto a un germoplasma parental de la especie, en donde la semilla mutante tiene una actividad alterada de una inositol polifosfato 2-quinasa según la presente invención.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un anticuerpo purificado generado usando un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2 como un inmunógeno.

Asimismo, la presente... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido vegetal aislado que codifica para una inositol polifosfato 2-quinasa, polinucleótido que codifica

un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2. 2. Un polinucleótido vegetal aislado como el reivindicado en la reivindicación 1, donde el polinucleótido comprende la SEC ID Nº: 1 ó la SEC ID Nº: 3.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el polinucleótido codifica para una inositol polifosfato 2-quinasa de maíz. 4. El polinucleótido de cualquier reivindicación precedente, donde el polinucleótido es ADN.

5. El polinucleótido de cualquier reivindicación precedente, donde el polinucleótido es ARN. 6. Una proteína vegetal aislada de inositol polifosfato 2-quinasa que comprende un polipéptido que tiene la secuencia fijada en la SEC ID Nº: 2.

7. Un método para identificar un tejido vegetal que comprende una lesión en un gen que codifica una inositol polifosfato 2-quinasa como la reivindicada en la reivindicación 6, que comprende:

(a) someter a un tejido vegetal a mutagénesis;

(b) obtener una muestra de ADN del tejido vegetal sometido a mutagénesis o de sus descendientes;

(c) evaluar el ADN de la muestra para determinar la lesión en el gen que codifica inositol polifosfato 2-quinasa.

8. El método de la reivindicación 7, donde la mutagénesis es mutagénesis por neutrones rápidos y el tejido vegetal es tejido de maíz. 9. Una semilla de maíz que contiene una lesión inducida artificialmente en un gen que codifica una inositol

polifosfato 2-quinasa como la reivindicada en la reivindicación 6, donde la lesión afecta a la actividad del gen que codifica la inositol polifosfato 2-quinasa y donde la lesión inducida artificialmente es un bloqueo génico. 10. Una planta de maíz producida mediante el cultivo de la semilla de la reivindicación 9.

11. La planta de maíz de la reivindicación 10, donde dicha planta ha sido despanojada. 12. Un cultivo de tejido de células regenerables que contienen la lesión inducida artificialmente en un gen que codifica inositol polifosfato 2-quinasa producida por la planta de la reivindicación 10.

13. El cultivo de tejido de la reivindicación 12, donde las células del cultivo de tejido proceden de un tejido seleccionado del grupo que consiste en hojas, polen, embriones, raíces, puntas de raíz, anteras, pelos, flores, granos, espigas, mazorcas, vainas y tallos.

14. Un método para disminuir el nivel de ácido fítico en un pienso para animales, que comprende: producir un pienso para animales a partir de una planta que contiene una lesión en un gen que codifica una inositol polifosfato 2quinasa como la reivindicada en la reivindicación 6, donde el pienso para animales tiene un nivel reducido de fitato.

15. Un método para disminuir el nivel de fósforo en los desechos de animales que comprende: proporcionar un pienso para animales procedente de una planta que incluye una lesión en un gen que codifica una inositol polifosfato 2-quinasa como la reivindicada en la reivindicación 6.

16. Una semilla mutante no letal de una especie de planta de cereal que se caracteriza por un bajo contenido de ácido fítico respecto al germoplasma parental de la especie, donde la semilla mutante tiene una actividad alterada de una inositol polifosfato 2-quinasa como la reivindicada en la reivindicación 6.

17. Un pienso para animales que comprende la semilla de la reivindicación 16. 18. Un anticuerpo purificado generado usando un polipéptido que comprende la SEC ID Nº: 2 como inmunógeno. 19. Un kit de inmunodetección que comprende, en un medio contenedor adecuado, el anticuerpo según la

reivindicación 18, y un reactivo de inmunodetección. 20. El anticuerpo purificado de la reivindicación 18, unido operativamente a una marca detectable. 21. Un método para aumentar el rendimiento de semilla de una planta, método que comprende:

(1) integrar en el genoma de la planta un vector para la transformación de células vegetales que comprende:

(a) secuencias de nucleótidos antisentido sustancialmente complementarias a (i) una porción correspondiente de una cadena de una molécula de ADN que codifica inositol polifosfato 2-quinasa, donde la molécula de ADN que codifica inositol polifosfato 2-quinasa se hibrida en condiciones de severidad baja o moderada con la SEC ID Nº: 1, ó (ii) una porción correspondiente de una secuencia de ARN codificada por dicha molécula de ADN que codifica inositol polifosfato 2-quinasa; y

(b) secuencias reguladoras ligadas operativamente a las secuencias de nucleótidos antisentido de tal modo que las secuencias de nucleótidos antisentido son expresadas en una célula vegetal en la cual es transformada; y

(2) cultivar dicha planta, donde dichas secuencias de nucleótidos antisentido son trascritas y unidas a dicha secuencia de ARN y se inhibe la expresión de un gen de inositol polifosfato 2-quinasa.

22. Un método para generar una planta mutante que tiene un rasgo deseado proporcionado por un bloqueo génico de un gen que codifica una inositol polifosfato 2-quinasa como la reivindicada en la reivindicación 6, método que comprende:

(a) proporcionar una colección de polen de planta o de semillas de planta;

(b) tratar dicha colección de polen de planta o de semillas de planta con irradiación seleccionada del grupo que 15 consiste en UV, irradiación gamma, rayos X y neutrones rápidos; y

(c) seleccionar las plantas mutantes que tengan el rasgo deseado.

23. El método de la reivindicación 22, donde la colección de semillas de planta es una colección de granos de maíz

o de semillas de canola.

24. El método de la reivindicación 23, donde la irradiación es con neutrones rápidos y donde el polen irradiado se 20 usa como fuente de la mutación.