Enzimas mejoradas.

Una GTP ciclohidrolasa II modificada seleccionada de Bacillus que muestra un incremento en la actividadespecífica de al menos alrededor de 10 % en comparación con la enzima no modificada correspondiente,

en la quese han sustituido restos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279,308 y/o 347 de SEQ ID NO:2, conduciendo dichas sustituciones a restos de aminoácidos seleccionados del grupoque consiste en:

(a) alanina en una posición que corresponde a la posición 261 de SEQ ID NO:2,

(b) alanina en una posición que corresponde a la posición 270 de SEQ ID NO:2,

(c) treonina en una posición que corresponde a la posición 276 de SEQ ID NO:2,

(d) arginina en una posición que corresponde a la posición 279 de SEQ ID NO:2,

(e) arginina en una posición que corresponde a la posición 308 de SEQ ID NO:2, y

(f) isoleucina en una posición que corresponde a la posición 347 de SEQ ID NO:2.

Enzimas mejoradas La presente invención proporciona enzimas modificadas con actividad de GTP ciclohidrolasa II mayor que las enzimas de tipo salvaje respectivas. Las enzimas modificadas y polinucleótidos que las codifican se pueden usar para la producción de riboflavina, precursores de riboflavina, mononucleótido de flavina (FMN) , dinucleótido de flavina y adenina (FAD) , y sus derivados.

La riboflavina (vitamina B2) es sintetizada por todas las plantas y muchos microorganismos, pero no es producida por animales superiores. Debido a que es un precursor de coenzimas tales como el dinucleótido de flavina y adenina y el mononucleótido de flavina, que son necesarios en la oxidación enzimática de hidratos de carbono, la riboflavina es esencial para el metabolismo básico. En animales superiores, una insuficiencia de riboflavina puede provocar pérdida del cabello, inflamación de la piel, deterioro de la visión, e insuficiencia del crecimiento.

La manipulación mediante ingeniería de cepas de producción de riboflavina con mayores velocidades y rendimientos de producción de riboflavina se ha logrado en el pasado de muchas maneras diferentes. Por ejemplo, (1) se usó mutagénesis clásica para generar variantes con mutaciones aleatorias en el genoma del organismo de elección, seguido de la selección por mayor resistencia a análogos de purina y/o identificando una mayor producción de riboflavina. (2) Como alternativa, las enzimas terminales de la biosíntesis de riboflavina, es decir, las enzimas que catalizan la conversión de trifosfato de guanosina (GTP) y ribulosa-5-fosfato en riboflavina, estaban sobreexpresadas, dando como resultado también un mayor flujo hacia el producto diana. Sin embargo, en este último enfoque, la fuerte sobreexpresión de las proteínas de la biosíntesis de riboflavina impone una carga metabólica adicional en las células hospedantes, lo que, a su vez, puede inducir reacciones de respuesta de estrés y otros efectos negativos indeseables en la fisiología de las células.

Las enzimas requeridas que catalizan la biosíntesis de riboflavina a partir de trifosfato de guanosina (GTP) y ribulosa-5-fosfato están codificadas por cuatro genes (ribG, ribB, ribA, y ribH) en B. subtilis. Estos genes están situados en un operón, cuyo orden génico difiere del orden de las reacciones enzimáticas catalizadas por las enzimas. Por ejemplo, GTP ciclohidrolasa II, que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de riboflavina, es codificada por el tercer gen en el operón, ribA. El gen ribA también codifica una segunda actividad enzimática, es decir, 3, 4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa (DHBPS) , que cataliza la conversión de ribulosa-5-fosfato a la unidad de cuatro carbonos 3, 4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato (DHBP) . La desaminasa y la reductasa son codificadas por el primer gen del operón, ribG. La penúltima etapa en la biosíntesis de la riboflavina está catalizada por lumazina sintasa, el producto del último gen rib, ribH. La riboflavina sintasa, que controla la última etapa de la ruta, es codificada por el segundo gen del operón, ribB. La función del gen situado en el extremo 3’ del operón rib es actualmente incierta; sin embargo, su producto génico no es necesario para la síntesis de riboflavina.

La transcripción del operón de riboflavina a partir del promotor ribP1 está controlada por un mecanismo de atenuación que implica una región líder reguladora situada entre ribP1 y ribG. Las mutaciones ribO en esta región líder dan como resultado la expresión desregulada del operón de riboflavina. La expresión desregulada también se observa en cepas que contienen mutaciones con cambio de sentido en el gen ribC. Se ha demostrado que el gen ribC codifica la flavina cinasa/FAD sintasa de B. subtilis (Mack, M., et al., J. Bacteriol., 180:950-955, 1998) . Las mutaciones desregulantes reducen la actividad de flavocinasa del producto del gen ribC dando como resultado concentraciones intracelulares reducidas de mononucleótido de flavina (FMN) , la molécula efectora del sistema regulador de riboflavina.

Recientemente, se modificó genéticamente mediante ingeniería a Bacillus subtilis para producir niveles elevados de riboflavina durante un ciclo de fermentación corto (patente U.S. nº 5.837.528) . Este enfoque combinó selección clásica de mutantes genéticos y mejora de la fermentación con ingeniería genética de los genes biosintéticos de riboflavina desregulando e incrementando el nivel de expresión génica. En este sistema, la expresión de los genes rib se incrementó al mutar el gen ribC que codifica flavocinasa, enlazando los genes rib a promotores constitutivos fuertes, e incrementando el número de copias de los genes rib.

Como ya se ha discutido anteriormente, la sobreexpresión de los genes rib plantea una carga adicional en las cepas de producción, lo cual puede tener, potencialmente, un impacto negativo sobre la producción de precursores de riboflavina, fiboflavina, FMN, FAD, o sus derivados. A fin de eludir este defecto, es un objeto de la presente invención describir mutantes de GTP ciclohidrolasa II con actividad específica incrementada. El uso de tales enzimas mutantes en cepas de producción, ya sea solas o combinadas con mutantes mejorados de las otras proteínas Rib, permitirá mayores velocidades de flujo con menos carga o ninguna carga adicional sobre el metabolismo de las células.

Como se usa aquí, la expresión “GTP ciclohidrolasa II” puede incluir cualquier enzima que sea capaz de catalizar la conversión de GTP en 2, 5-diamino-6-ribosilamino-4 (3H) -pirimidinona-5’-fosfato DRAPP) . Es irrelevante si esta enzima es capaz de catalizar otras reacciones, como por ejemplo la conversión de ribulosa-5-fosfato en DHBP. Una “GTP ciclohidrolasa II” puede ser homóloga a una o más de las enzimas cuyas secuencias de aminoácidos se muestran en la Figura 1 o en la Tabla 4. “Homóloga” se refiere a una GTP ciclohidrolasa II que es al menos alrededor de 50% idéntica, preferiblemente al menos alrededor de 60% idéntica, más preferiblemente al menos alrededor de 70%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 80%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 85%, incluso más preferiblemente al menos alrededor de 90% o 95% idéntica, y lo más preferible al menos alrededor de 98% idéntica a una o más de las secuencias de aminoácidos como se muestran en la Figura 1 o en la Tabla 4.

La expresión “% de identidad”, como se conoce en la técnica, significa el grado de relación entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, como se determina mediante el emparejamiento entre cadenas de tales secuencias. La “identidad” se puede determinar fácilmente mediante métodos conocidos, por ejemplo con el programa BESTFIT (GCG Wisconsin Package, versión 10.2, Accelr y s Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, USA) usando los siguientes parámetros: penalización de creación de salto 8, penalización de extensión de salto 2 (parámetros por defecto) .

“Enzima de tipo salvaje” o “GTP ciclohidrolasa II de tipo salvaje” puede incluir cualquier GTP ciclohidrolasa II homóloga a una cualquiera de las enzimas mostradas en la Figura 1 o en la Tabla 4 que se usa como punto de partida para diseñar mutantes con mayor actividad según la presente invención. “Tipo salvaje”, en el contexto de la presente invención, puede incluir tanto secuencias de GTP ciclohidrolasa II derivables de la naturaleza así como variantes de enzimas GTP ciclohidrolasa II sintéticas (en tanto que sean homólogas a una cualquiera de las secuencias mostradas en la Figura 1 o en la Tabla 4) , si se pueden hacer más activas mediante cualquiera de las enseñanzas de la presente invención. Las expresiones “GTP ciclohidrolasa II de tipo salvaje” y “GTP ciclohidrolasa II no modificada” se usan aquí de forma intercambiable.

Un “mutante”, “enzima mutante”, o “GTP ciclohidrolasa II mutante”, puede incluir cualquier variante derivable de una enzima/ GTP ciclohidrolasa II de tipo salvaje dada (según la definición anterior) de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, y que es más activa que la enzima de tipo salvaje respectiva. Para el alcance de la presente invención, no es relevante cómo se obtiene el mutante o mutantes; tales mutantes se pueden obtener, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de saturación, mutagénesis al azar/evolución dirigida, mutagénesis química o por UV de todas las células/organismos, y otros métodos que son conocidos en la técnica. Estos mutantes también se pueden generar, por ejemplo, diseñando genes sintéticos,... [Seguir leyendo]

1. Una GTP ciclohidrolasa II modificada seleccionada de Bacillus que muestra un incremento en la actividad específica de al menos alrededor de 10 % en comparación con la enzima no modificada correspondiente, en la que se han sustituido restos de aminoácidos en las posiciones que corresponden a las posiciones 261, 270, 276, 279, 308 y/o 347 de SEQ ID NO:2, conduciendo dichas sustituciones a restos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

(a) alanina en una posición que corresponde a la posición 261 de SEQ ID NO:2,

(b) alanina en una posición que corresponde a la posición 270 de SEQ ID NO:2,

(c) treonina en una posición que corresponde a la posición 276 de SEQ ID NO:2,

(d) arginina en una posición que corresponde a la posición 279 de SEQ ID NO:2,

(e) arginina en una posición que corresponde a la posición 308 de SEQ ID NO:2, y

(f) isoleucina en una posición que corresponde a la posición 347 de SEQ ID NO:2.

2. Una GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 1, que comprende mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en V261A, G270A, A276T, Q279R, K308R, y M347I, en la que dichas posiciones corresponden a las posiciones respectivas de SEC ID NO:2.

3. Una GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 2, seleccionada de Bacillus subtilis.

4. Una GTP ciclohidrolasa II modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una combinación de mutaciones 276T/279R/308R/347I, en la que las posiciones corresponden a las posiciones respectivas de SEC ID NO:2.

5. La GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 1, en la que la secuencia de la GTP ciclohidrolasa II no modificada se selecciona del grupo que consiste en las secuencias ID NOs:2, 39, 41, y 43.

6. Un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una GTP ciclohidrolasa II modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. El polinucleótido que codifica la GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 6, seleccionándose dicho polinucleótido del grupo que consiste en las secuencias ID NOs:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26.

8. Una célula hospedante que comprende un polinucleótido según la reivindicación 6 ó 7.

9. La célula hospedante según la reivindicación 8, que se selecciona de Bacillus.

10. Un procedimiento para producir riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos, que comprende:

(a) cultivar la célula hospedante según la reivindicación 8 ó 9 en un medio adecuado; y

(b) opcionalmente separar riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos, del medio.

11. Un procedimiento para la producción de riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos, que comprende:

(a) proporcionar una célula hospedante seleccionada de Bacillus que comprende una GTP ciclohidrolasa II modificada según la reivindicación 1;

(b) cultivar dicha célula hospedante en un medio adecuado, y

(c) opcionalmente separar riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos, del medio.

12. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en el que la célula hospedante se selecciona de Bacillus subtilis.

13. El uso de una GTP ciclohidrolasa II modificada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un polinucleótido según la reivindicación 7, para incrementar la producción de riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, o un derivado de los mismos.

Figura 1 gch2_cangu: geneseqp:aay69776 (Candida guilliermondii) gch2_ashgo: TrEMBL: CAA02912: (Ashbya gossypii (Eremothecium gosypii) ) gch2_yeast: SWISS-PROT: gch2_yeast (Saccharomyces cerevisiae) gch2_neucr: TrEMBL: Q871B3 (Neurospora crassa) gch2_schpo: TrEMBL: Q9P7M9 (Schizosaccharomyces pombe) gch2_arcfu: SWISS-PROT: gch2_arcfu (Archaeoglobus fulgidus) gch2_strco: SWISS-PROT: gch2_strco (Streptomyces coelicolor) gch2_helpj: SWISS-PROT: gch2_helpj (Helicobacter pylori J99) gch2_helpy: SWISS-PROT: gch2_helpy (Heliobacter pylori) gch2_pyrfu: TrEMBL: Q8U4L7 (Pyrococcus furiosus) gch2_thema: SWISS-PROT: gch2_thema (Thermotoga maritima) gch2_chlmu: SWISS-PROT: gch2_chlmu (Chlamydia muridarum) gch2_chltr: SWISS-PROT: gch2_chltr (Chlamydia trachomatis) gch2_chlca: TrEMBL: AAP05635 (Chlamydia caviae GPIC) gch2_chlpn: SWISS-PROT: gch2_chlpn (Chlamydia pneumoniae) gch2_arath: SWISS-PROT: gch2_arath (Arabidopsis thaliana) gch2_lyces: TrEMBL: CAC09119 (Lycopersicum esculentum) gch2_or y sa: TrEMBL: AA072560 (Or y za sativum) gch2_alceu: TrEMBL: Q9F184 (Alcaligenes eutrophus) gch2_neima: SWISS-PROT: gch2_neima (Neisseria meningitidis (serogrupo A) ) gch2_neimb: SWISS-PROT: gch2_neimb (Neisseria meningitidis (serogrupo B) ) gch2_psepk: SWISS-PROT: gch2_psepk (Pseudomonas putida (cepa KT2440) ) gch2_psesm: SWISS-PROT: gch2_psesm (Pseudomonas syringae (pv. tomate ) ) gch2_actac: TrEMBL: Q9JRR0 (Actinobacillus actinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans) ) gch2_haein: SWISS-PROT: gch2_pasmu gch2_haein (Haemophilus influenzae) gch2_pasmu: SWISS-PROT: (Pasteurella multocida) gch2_ec06: TrEMBL: Q8FHU5 (Escherichia coli 06) gch2_ecoli: SWISS-PROT: gch2_ecoli (Escherichia coli) gch2_salty: TrEMBL: Q8XFY7 (Salmonella typhimurium) gch2_yerpe: TrEMBL: Q8ZEF0 (Yersinia pestis) _ gch2_bucai: SWISS-PROT: gch2_bucai (Buchnera aphidicola (subsp. Acyrthosiphon pisum) (Acyrthosiphon pisum

bacteria simbiótica ) ) gch2_bucap: SWISS-PROT: gch2_bucap (Buchnera aphidicola (subsp. Schizaphis graminum) ) gch2_wigbr: SWISS-PROT: gch2_wigbr (Wigglesworthia glossinidia brevipalpis) gch2_bucbp: SWISS-PROT: gch2_wigbr (Buchnera aphidicola (subsp. Baizongia pistaciae) ) gch2_mycle: TrEMBL: Q9CCP4 (Mycobacterium leprae)

gch2_myctu: SWISS-PROT: gch2_myctu (Mycobacterium tuberculosis) gch2_coref: TrEMBL: Q8FT57 (Cor y nebacterium efficiens) gch2_corgl: GENESEQP: AAB79913 (Cor y nebacterium glutamicum) gch2_coram: SWISS-PROT: gch2_coram (Cor y nebacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes) ) gch2_staau: TrEMBL: Q8NW14 (Staphylococcus aureus (cepa MW2) ) gch2_staep: GENESEQP: ABP40248 (Staphylococcus epidermidis) gch2_actpl: SWISS-PROT: gch2_actpl (Actinobacillus pleuropneumoniae) gch2_lacla: TrEMBL: Q9CGU7 (Lactococcus lactis (subsp. lactis) (Streptococcus lactis) ) gch2_stcag: TrEMBL: Q8E658 (Streptococcus agalactiae (serotipo III) ) gch2_stcpn: TrEMBL: Q8DRF1 (Streptococcus pneumoniae (cepa ATCC BAA-255 / R6) ) gch2_cloac: TrEMBL: Q97LG9 (Clostridium acetobutylicum) gch2_fusnu: TrEMBL: Q8RIR1 (Fusobacterium nucleatum (subsp. nucleatum) ) gch2_anasp: TrEMBL: Q8RIR1 (Anabaena sp. (cepa PCC 7120) ) gch2_syny3: SWISS-PROT: gch2_syny3 (Synechocystis sp. (cepa PCC 6803) ) gch2_synel: TrEMBL: Q8DI64 Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus) gch2_bacam: SWISS-PROT: gch2_bacam (Bacillus amyloliquefaciens) gch2_bacsu: SWISS-PROT: gch2_bacsu (Bacillus subtilis) gch2_bacce: TrEMBL: AAP11030 (Bacillus cereus ATCC 14579) gch2_bacha: TrEMBL: Q9KCL5 (Bacillus halodurans) gch2_clope: TrEMBL: Q8XMX0 (Clostridium perfringens) gch2_clote: TrEMBL: Q897Q8 (Clostridium tetani) gch2_chlte: TrEMBL: Q8KC35 (Chlorobium tepidum) gch2_aquae: SWISS-PROT: gch2_aquae (Aquifex aeolicus) gch2_lepin: TrEMBL: Q8F701 (Leptospira interrogans) gch2_deira: TrEMBL: Q9RXZ9 (Deinococcus radiodurans) gch2_bacth: TrEMBL: Q8A528 (Bacteroides thetaiotaomicron) gch2_caucr: TrEMBL: Q9A9S5 (Caulobacter crescentus) gch2_coxbu: TrEMBL: AA090191 (Coxiella burnetii RSA 493) gch2_rhiet: TrEMBL: Q8KL38 (Rhizobium etli) gch2_lacpl: TrEMBL: Q88X17 (Lactobacillus plantarum) gch2_psegl: TrEMBL: Q8RS38 (Pseudomonas glumae) gch2_strav: TrEMBL: BAC71833 (Streptomyces avermitilis) gch2_phopo: SWISS-PROT: gch2_phopo (Photobacterium phosphoreum) gch2_azobr: SWISS-PROT: gch2_azobr (Azospirillum brasilense) gch2_agrtu: TrEMBL: Q8UHC9 (Agrobacterium tumefaciens (cepa C58 / ATCC 33970) ) gch2_rhime: TrEMBL: Q92RH2 (Rhizobium meliloti (Sinorhizobium meliloti) ) gch2_brume: TrEMBL: Q8YFL5 (Brucella melitensis)

gch2_brusu: TrEMBL: Q8G298 (Brucella suis) gch2_rhilo: TrEMBL: Q985Z3 (Rhizobium loti (Mesorhizobium loti) ) gch2_braja: TrEMBL: Q89RZ7 (Bradyrhizobium japonicum) gch2_niteu: TrEMBL: CAD86468 (Nitrosomonas europaea ATCC 19718)

gch2_ralso: TrEMBL: Q8Y1H7 (Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum) ) gch2_neime: TrEMBL: Q9JZ77 (Neisseria meningitidis (serogrupo B, segunda enzima encontrada) ) gch2_xanax: TrEMBL: Q8PPD7 (Xanthomonas axonopodis (pv. citri) ) gch2_xanca: TrEMBL: Q8PCM8 (Xanthomonas campestris (pv. campestris) ) gch2_vibpa: TrEMBL: Q87RU5 (Vibrio parahaemolyticus)

gch2_vibvu: TrEMBL: Q8DF98 (Vibrio vulnificus) gch2_vibch: TrEMBL: Q9KPU3 (Vibrio cholerae) gch2_vibfi: TrEMBL: Q8G9G5 (Vibrio fischeri) gch2_sheon: TrEMBL: Q8EBP2 (Shewanella oneidensis) gch2_phoph: TrEMBL: Q8G9H7 (Photobacterium phosphoreum)

ribb_phole: TrEMBL: Q93E93 (Photobacterium leiognathi) gch2_psepu: TrEMBL: Q88GB1 (Pseudomonas putida (cepa KT2440, segunda enzima encontrada) ) gch2_psesy: TrEMBL: Q882G0 (Pseudomonas syringae (pv. Tomate, segunda enzima encontrada) ) gch2_pseae: TrEMBL: Q9HWX4 (Pseudomonas aeruginosa) ribb_dehmu: SWISS-PROT: ribb_dehmu (Dehalospirillum multivorans)

gch2_xylfa: TrEMBL: Q87D69 (Xylella fastidiosa (cepa Temeculal / ATCC 700964) )