Efectos analgésicos de la toxina peptídica APETX2.

La toxina peptídica APETx2 de la anémona de mar Anthopleura elegantissima,

péptidos aislados de otrosvenenos de la anémona de mar y otras especies marinas de la misma familia con 60 a 99% de identidad desecuencia con la secuencia de 42 aminoácidos de la toxina peptídica APETx2, y péptidos aislados del veneno de laanémona de mar Anthopleura elegantissima que tiene (i) al menos una sustitución en las posiciones 3, 5, 8, 9, 10,15-17, 23, 31-33 , 36, 39 y 41 o (ii) una extensión de al menos un aminoácido en los extremo N-y/o C terminales dela secuencia de 42 aminoácidos de la toxina peptídica APETx2, para uso como medicamento analgésico,dichos péptidos conservando la propiedad de la toxina peptídica para inhibir los canales de tipo APETx2 ASIC3.

Efectos analgésicos de la toxina peptídica APETX2

Campo técnico de la invención [0001] La invención se refiere al uso del de la toxina peptídica de canales de cationes APETx2 inhibidora de los canales de cationes ASIC3 resultante de la anémona de mar Anthopleura elegantissima por sus efectos analgésicos con respecto al dolor asociado con la activación de los isoforma ASIC3 (Acid Sensing Ion Channel 3) durante la inflamación y también potencialmente en todas las situaciones dolorosas asociadas con acidosis tisular (isquemia, fracturas, hematomas, hinchazón, ampollas, infecciones locales, daño tisular, lesiones en los ojos, tumores, etc., ) .

Estado de la técnica anterior

La consideración y el tratamiento del dolor, incluyendo la inflamación, son esenciales para mejorar la calidad de vida de los pacientes, y se basan principalmente en la prescripción de fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) o esteroideos. Cuando los AINE y/o corticosteroides no son suficientes para aliviar el dolor inflamatorio, el médico combina un analgésico anti-inflamatorio, por ejemplo paracetamol, con opioides débiles o fuertes. Sin embargo, a pesar de la diversidad del arsenal terapéutico existente, muchos dolores permanecen poco sensibles a medicamentos analgésicos conocidos que pueden además generar efectos secundarios no deseados, como en el caso de los AINE. En este contexto, el descubrimiento de nuevos objetivos analgésicos representaría, por lo tanto, un progreso real. Entre las dianas moleculares identificadas en los últimos años, los canales iónicos juegan un importante papel especialmente porque están directamente involucrados en la detección y transmisión de señales de dolor por fibras nociceptivas.

Los ASICs (Acid Sensing Ion Channels) son canales catiónicos activados por acidosis extracelular (para revisión, [ref. 1] y [r e f. 2]) . Hasta ahora, cuatro genes que codifican al menos siete subunidades (ASIC1a, ASIC1b, ASIC1b2, ASIC2A, ASIC2B, ASIC3 y ASIC4) se han identificado en mamíferos. Los canales funcionales ASIC resultan de la combinación de diferentes subunidades de ASIC en trímeros ([ref. 3]) que conducen a canales homoméricos o heteroméricos ([ref. 4, 5 y 6]) . Los canales ASIC son predominantemente canales neuronales expresadas en los sistemas nerviosos central y periférico. Mientras que los canales ASIC1a y ASIC2 están ampliamente presentes en los sistemas nerviosos central y periférico, la expresión de los canales ASIC3 y ASIC1b está restringida a las neuronas sensoriales ([ref. 7, 57 y 8]) .

Se ha postulado que los ASIC son capaces de detectar la acidificación extracelular que se puede desarrollar durante la isquemia, inflamaciones, hematomas, fracturas, lesiones, cirugía (dolor postoperatorio) , o el desarrollo de determinados tumores ([ref. 9]) . Se sabe desde hace varios años que la acidosis extracelular genera dolor ([ref. 11 y 12]) , y algunos experimentos llevados a cabo en voluntarios humanos sanos ([ref 13 y 14.]) han demostrado la implicación de los ASICs en el dolor cutáneo ácido con la ayuda de amilorida y algunos AINEs, inhibidores inespecíficos de los ASICs ([ref. 15 y 17]) .

Entre todas las subunidades de ASIC que expresan las neuronas sensoriales, ASIC3 es de particular interés debido a que se expresa ampliamente en neuronas nociceptivas ([ref 7.], supra; ref [17 y 18. ]) , y genera una corriente no inactivante, persistente en respuesta a la acidificación moderada (hasta aproximadamente pH 7, 0) ([ref. 19]) . El ASIC3 actual tiene en efecto dos componentes: (1) un componente transitorio que es altamente sensible al pH (PH0, 5 = 6, 5 a 6, 7) ([ref 7.], supra; [ref 20.] ) rápidamente activante (t0.5 <5 ms) e inactivante (t0.5 = 0, 32 s) ([ref. 20], supra) , y (2) un componente sostenido que resulta de la acidificación moderada (pH entre 7, 3 y 6, 7) de la corriente de ventana a partir de la superposición parcial de las curvas de activación e inactivación del canal ([ref. 19], supra) y para pHs más ácidos (pH <6, 0) de un mecanismo aparentemente diferente. La corriente transitoria se recupera rápidamente después de la inactivación después de un retorno a pH neutro (t0.5 = 0, 58 s) ([ref. 20], supra) . Para la comparación, ASIC1a requiere un tiempo de recuperación mucho más largo (t0.5 = 13s) ([ref. 20], supra) . La corriente transitoria se inactiva rápidamente cuando el pH de reposo es ácido. Por el contrario, la corriente sostenida todavía puede activarse cuando el pH disminuye partir de un pH de reposo relativamente ácido (<pH 6) y también se activa cuando el pH extracelular disminuye gradualmente ([ref. 7], supra) . Estudios recientes en ratones knockout sugieren una función de ASIC3 en la detección de la acidosis tisular en los músculos y articulaciones en modelos de hiperalgesia mecánica secundaria inducida por inflamación o por inyecciones repetidas de ácido en el músculo ([ref. 21, 22, 23 y 60]) . La participación de ASIC3 en la mecano sensibilidad de las neuronas sensoriales de gran también se ha postulado ([ref. 21]) . Sin embargo, la comparación de los ratones normales y ratones knockout no mostraron una importante función de ASIC3 en el dolor cutáneo ácido o hipersensibilidad cutánea al dolor asociado con la inflamación ([ref. 21] y sobre [ref. 25]) .

Además, si los estudios pueden en el mejor de los casos predecir que la inhibición de la actividad de ASIC3 podría a priori afectar al dolor, la implicación real de los ASIC y la contribución relativa de las diferentes isoformas presentes en las neuronas sensoriales , especialmente ASIC3, en la sensibilidad en vivo de los nociceptores al ácido y en el dolor cutáneo ácido en condiciones normales o inflamatorias aún no se han demostrado. Además, tampoco se ha demostrado cómo podría afectar el dolor la hiperalgesia, analgesia y la inhibición de la actividad de los ASIC,

especialmente ASIC3. Sin embargo, los análisis adicionales requeridos necesitan de herramientas farmacológicas selectivas.

Hasta hace poco tiempo, el repertorio de ligandos activos capaces de inhibir ASIC3 se limitaba principalmente a amilorida y fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINEs) ([ref. 7] supra y [ref. 17] , supra) . Sin embargo, ninguno de estos fármacos es absolutamente específicos de los canales ASIC o un tipo particular de canal ASIC, y, especialmente, ASIC3.

Durante muchos años, los venenos de animales han producido un gran número de toxinas que pueden modular específicamente con alta afinidad las corrientes Ca2 +, K + y Na + dependientes de voltaje ([ref. 28, 29, 30, 31, 32 , 33]) , el canal de potasio dependiente de Ca2 + ([ref. 34 y 35]) , y los canales de potasio mecanosensibles ([ref. 58]) . Recientemente, se identificaron dos toxinas animales (PcTx1 y APETx2) capaces de bloquear específicamente canales ASIC1A ([ref. 36]) y ASIC3 ([ref. 38]) , respectivamente.

Con el fin de identificar efectores específicos del canal ASIC3, un gran número de venenos de escorpión, abeja, araña, serpiente y anémona de mar (dilución 1/1000) o fracciones de péptidos (0, 1 mg/ml) se han cribado en relación a los canales ASIC3 expresados en ovocitos de Xenopus. Se ha demostrado que una fracción peptídica de la anémona de mar Anthopleura elegantissima inhibe más del 80% de la corriente de ASIC3 en rata estimulada a pH

6. El péptido activo se purificó hasta homogeneidad por cromatografía en fase inversa y de intercambio catiónico seguido de un recorrido por las fracciones activas de ASIC3, y se denomino APETx2 ([ref. 38]) .

APETx2 es un péptido de 42 aminoácidos con tres puentes disulfuros, con una organización estructural similar a otras toxinas de anémona de mar que bloquean los canales de potasio y de sodio sensibles al voltaje. Su secuencia completa se determinó por degradación N-terminal de Edman, y su masa monoisotópica medida (4557, 96 Da) está en buen acuerdo con la masa calculada a partir de los datos de secuencia (4557, 88 Da, precisión 17 5 ppm) , que indica una extremidad C- terminal libre. APETx2 tiene un 64% de identidad (76% de homología) con la secuencia APETx1 ([ref. 40]) y sólo el 34% de identidad de secuencia (57 y 55% de homología, respectivamente) con las toxinas BDS- 1 y BDS-II de Anemonia sulcata, que inhiben la corriente de potasio Kv3.4 dependiente de voltaje ([ref. 41]) . La identidad de secuencia con péptidos activadores de las corrientes de sodio, tales como AP-A, B-AP, AP-C, 1-APE1, APE-2 sp de Anthopieura. ([Ref. 39]) es sólo del 25-29% (41-47% de homología) . Además, APETx2 no tiene ninguna homología de secuencia con PcTx1, el inhibidor específico de la isoforma ASIC1a ([ref. 36], supra) .

APETx2 bloquea directamente ASIC3 actuando en su parte exterior, y no altera... [Seguir leyendo]

1. La toxina peptídica APETx2 de la anémona de mar Anthopleura elegantissima, péptidos aislados de otros venenos de la anémona de mar y otras especies marinas de la misma familia con 60 a 99% de identidad de secuencia con la secuencia de 42 aminoácidos de la toxina peptídica APETx2, y péptidos aislados del veneno de la anémona de mar Anthopleura elegantissima que tiene (i) al menos una sustitución en las posiciones 3, 5, 8, 9, 10, 15-17, 23.

3. 33 , 36, 39 y 41 o (ii) una extensión de al menos un aminoácido en los extremo N-y/o C terminales de la secuencia de 42 aminoácidos de la toxina peptídica APETx2, para uso como medicamento analgésico , dichos péptidos conservando la propiedad de la toxina peptídica para inhibir los canales de tipo APETx2 ASIC3.

2. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para uso de acuerdo con la reivindicación 1 en la prevención o el tratamiento del dolor inducido por activación de los canales de tipo ASIC3de.

3. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el dolor resulta de la inflamación.

4. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el dolor se produce por acidosis tisular.

5. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para su uso según la reivindicación 4, en el que las condiciones dolorosas se seleccionan del grupo que consistente en isquemias, fracturas, hematomas, edema, formación de ampollas, infecciones locales, incluyendo lesiones tisulares, incisiones relacionadas con un procedimiento quirúrgico, lesiones oculares y tumores incluyendo tumores y metástasis óseas.

6. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para uso de acuerdo con la reivindicación 1 en la prevención o tratamiento del prurito.

7. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho medicamento se administra de manera periférica.

8. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para su uso según en la reivindicación 7, en el que dicho medicamento es para ser administrado por vía subcutánea.

9. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para su uso según la reivindicación 7, en el que dicho medicamento es para ser administrado por vía intramuscular.

10. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para su uso según la reivindicación 7, en el que dicho medicamento es para ser administrado por vía transcutánea.

11. La toxina peptídica APETx2 y péptidos para su uso según la reivindicación 7, en el que dicho medicamento es para ser administrado por vía cutánea.