Dispositivos actuadores de gotitas y métodos que emplean perlas magnéticas.

Un método para proporcionar una gotita (218) en contacto con una perlas magnéticamente sensible (220) yque tiene un cantidad reducida de una sustancia,

comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar un actuador de gotitas (300) que comprende:

(i) un sustrato (210) que comprende electrodos (214) dispuestos para llevar a cabo las operacionesde gotitas sobre una superficie y

(ii) una gotita de iniciación (218/222) que comprende:

(1) una o más perlas magnéticamente sensibles (220);

(2) una cantidad inicial de la sustancia; y

(3) un volumen inicial;

(b) inmovilizar magnéticamente la una o más perlas magnéticamente sensibles (220) en una posición queestá a una distancia de una zona de partición de gotita objetivo (224), y

(c) realizar una o más operaciones de gotitas que comprenden operaciones de división seleccionadas paradividir la gotita inicial (218/222) para producir un conjunto de gotitas que comprende:

(i) una gotita (218) que comprende sustancialmente todas de la una o más perlas magnéticamentesensibles (220) y que tiene una cantidad disminuida de la sustancia con relación a laconcentración inicial; y

(ii) una gotita (222) que carece sustancialmente de perlas magnéticamente sensibles;

caracterizado porque:

en la etapa (b), inmovilizar mecánicamente la una o más perlas magnéticamente sensibles (220) por medio deimanes (310a, 310b; 410a, 410b) dispuestos encima y debajo de la gotita inicial (218/222) con los polos opuestosenfrentados entre sí.

Dispositivos actuadores de gotitas y métodos que emplean perlas magnéticas 3 Campo de la Invención La presente invención se refiere generalmente al campo de actuadores de gotitas, y en particular a actuadores de gotitas configurados para conducir protocolos basados en gotitas que requieren operaciones de gotitas para ser conducido que utilizan gotitas que comprenden perlas, especialmente perlas magnéticamente sensibles. La invención se refiere también a métodos de fabricación y utilización de tales actuadores de gotitas.

Antecedentes de la Invención Los actuadores de gotitas son utilizados para llevar a cabo una gran variedad de operaciones de gotitas. Un actuador de gotitas típicamente incluye un sustrato asociado con electrodos para llevar a cabo las operaciones de gotitas en una superficie de operaciones de gotitas del mismo y también puede incluir un segundo sustrato dispuesto en de una forma generalmente paralela con relación a la superficie de operaciones de gotitas para formar una separación en la que se efectúan las operaciones de gotitas. La separación típicamente está rellena de un fluido rellenador que es inmiscible en el fluido que va a ser sometido a operaciones de gotitas sobre el actuador de gotitas.

En algunas aplicaciones del actuador de gotitas existe una necesidad de utilizar “perlas” para diversos ensayos. Para protocolos que hacen uso de perlas, las perlas se utilizan típicamente para unir una o más sustancias objetivo en una mezcla de sustancias. Las sustancias objetivo pueden, por ejemplo ser analitos o contaminantes. Existe una necesidad de un enfoque eficiente para el lavado de perla en un actuador de gotitas para reducir la cantidad de una o más sustancias en la gotita que contiene perlas que puede estar en contacto con o expuesta a la superficie de la perla o perlas.

NICOLE WEAVER: “Application of magnetic microspheres to pyrosequencing on a digital microfluid platform” [Online] 2005, XP002485691 (Recuperado de Internet:

URL: http://ece.duke.edu/undergrads/IndStudy05/Weaver_Rpt2005.pdf> [recuperado el ]) y WO2007/120240 [publicado después de los datos de prioridad reivindicados por la presente solicitud) exponen el uso de imanes para inmovilizar perlas magnéticas en pirosecuenciación de microfluido de base de gotita, estando los imanes situados o bien encima o bien debajo de la gotita.

Breve Descripción de la Invención La invención, como está definida en las reivindicaciones adjuntas, proporciona la inmovilización eficiente de perlas de sensibles magnéticamente para operaciones de gotitas que hacen uso de perlas sensibles magnéticamente en aplicaciones con base de gotita. Ejemplos incluyen ensayos que requieren la ejecución de protocolos de lavado de perlas, tales como aplicaciones de pirosecuenciación e inmunoensayos. En un ejemplo, la invención proporciona técnicas que empelan fuerzas magnéticas para inmovilizar perlas sensibles magnéticamente durante operaciones de división de gotita. Las técnicas de la invención son particularmente útiles en protocolos para el lavado de perlas magnéticamente sensibles dentro de un actuador de gotitas. Entre otras ventajas, las técnicas de la invención evitan el agrupamiento o agregación excesivos de las perlas magnéticamente sensibles. Durante las operaciones de dividido, las técnicas pueden útilmente inmovilizar sustancialmente todas las perlas magnéticamente sensibles dentro de una gotita. Las técnicas de la invención pueden asegurar la inmovilización y retención de sustancialmente todas las perlas magnéticamente sensibles durante una operación de lavado de gotita. Después de finalizar el proceso de lavado, las técnicas de la invención aseguran la resuspensión de sustancialmente todas las perlas magnéticamente sensibles dentro del líquido y sin sustancialmente agrupamiento ni agregación de las mismas.

Definiciones Los siguientes términos, como se han empleado aquí tienen los significados indicados.

“Activar” con referencia a uno o más electrodos significa efectuar un cambio en el estado eléctrico de uno o más electrodos lo que da lugar a una operación de gotita.

“Perla” con respecto a perlas en un actuador de gotitas, significa cualquier perla o partícula que es capaz de interactuar con una gotita en o en las proximidades de un actuador de gotitas. Las perlas pueden tener cualquier tipo de forma, tales como esféricas, generalmente esféricas, forma de huevo, forma de disco, cúbicas u otras formas tridimensionales. La perla puede, por ejemplo, ser capaz de ser transportadas en una gotita o sobre un actuador de gotitas o ser configurada de otro modo con respecto a un actuador de gotitas de manera que permite que una gotita sobre el actuador de gotitas sea llevado a contacto con la perla, sobre el actuador de gotitas y/o separado del actuador de gotitas. Las perlas pueden ser fabricadas utilizando una amplia variedad de materiales, incluyendo por ejemplo resinas y polímeros. Las perlas pueden tener cualquier tamaño adecuado, incluyendo por ejemplo, microperlas, micropartículas, nanoperlas y nanopartículas. En algunos casos, las perlas son sensibles magnéticamente; en otros casos, las perlas no son sensibles magnéticamente de forma significativa. Para perlas sensibles magnéticamente, el material magnéticamente sensible puede formar el total de la perla o sólo un componente de una perla. El resto de la perla puede incluir, entre otras cosas, material polímero, revestimientos, y fracciones que permiten la unión de reactivo de ensayo. Ejemplos de perlas sensibles magnéticamente se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2005-0260686, titulada ”Multiplex flow assays preferably with magnetic particles as solid phase” publicada el 24 de Noviembre de 2005. Las perlas pueden incluir una o más poblaciones de células biológicas adheridas a las mismas. En algunos casos, las células biológicas son una población sustancialmente pura. En otros casos, las células biológicas incluyen diferentes poblaciones, por ejemplo, poblaciones de células que interactúan entre sí.

“Gotita” significa un volumen de líquido en un actuador de gotitas que está al menos parcialmente, unido por un fluido rellenador. Por ejemplo, una gotita puede estar completamente rodeada por un fluido rellenador o puede estar delimitado por un fluido rellenador y una o más superficies del actuador de gotitas. Los gotitas pueden adoptar una amplia variedad de formas: ejemplos no limitativos incluyen formas generalmente de disco, formas de bala, esfera truncada, elipsoide, esférica, estera parcialmente comprimida, semiesférica, ovoide, cilíndrica, y diversas formas conformadas durante las operaciones de gotitas, tales como la fusión o división o formadas como resultado del contacto de tales formas con una o más superficies de un actuador de gotitas.

“Operación de gotita” significa cualquier manipulación de una gotita en un actuador de gotitas. Una operación de gotita puede incluir, por ejemplo: cargar una gotita en el actuador de gotitas; dispensar una o más gotitas desde una gotita de fuente; dividir, separar o partir una gotita en dos o más gotitas; transportar una gotita desde una posición a otra en cualquier dirección; fusionar o combinar dos o más gotitas en una único gotita, diluir una gotita; mezclar una gotita; agitar una gotita; deformar una gotita; retener una gotita en su posición; incubar una gotita; calentar una gotita; vaporizar una gotita; enfriar una gotita; deshacerse de una gotita: transportar una gotita fuera de un actuador de gotitas; otras operaciones de gotitas descritas aquí; y/o combinaciones de las anteriores. Los términos “fusionar”, “fusión”, “combinar”, “combinación” y similares son utilizados para describir la creación de una gotita a partir de dos o más gotitas. Se ha de entender que cuando se utiliza tal término con referencia a dos o más gotitas, se puede utilizar cualquier combinación de operaciones de gotitas suficiente para dar lugar a la combinación de dos o más gotitas en una gotita. Por ejemplo “fusionar una gotita A con una gotita B” se puede conseguir transportando la gotita A hasta entrar en contacto con la gotita estacionaria B, transportando la gotita B hasta entrar en contacto con la gotita estacionaria A, o transportador las gotitas A y B hasta que entren en contacto entre sí. Los términos “partición”, “separación” y “división” no están destinados a implicar ningún resultado particular con respecto al tamaño de los gotitas resultantes (es decir, el tamaño de los gotitas resultantes puede ser el mismo o diferente) o el número de gotitas resultantes... [Seguir leyendo]

1. Un método para proporcionar una gotita (218) en contacto con una perlas magnéticamente sensible (220) y que tiene un cantidad reducida de una sustancia, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar un actuador de gotitas (300) que comprende:

(i) un sustrato (210) que comprende electrodos (214) dispuestos para llevar a cabo las operaciones de gotitas sobre una superficie y

(ii) una gotita de iniciación (218/222) que comprende:

(1) una o más perlas magnéticamente sensibles (220) ;

(2) una cantidad inicial de la sustancia; y

(3) un volumen inicial;

(b) inmovilizar magnéticamente la una o más perlas magnéticamente sensibles (220) en una posición que está a una distancia de una zona de partición de gotita objetivo (224) , y

(c) realizar una o más operaciones de gotitas que comprenden operaciones de división seleccionadas para dividir la gotita inicial (218/222) para producir un conjunto de gotitas que comprende:

(i) una gotita (218) que comprende sustancialmente todas de la una o más perlas magnéticamente sensibles (220) y que tiene una cantidad disminuida de la sustancia con relación a la concentración inicial; y

(ii) una gotita (222) que carece sustancialmente de perlas magnéticamente sensibles;

caracterizado porque:

en la etapa (b) , inmovilizar mecánicamente la una o más perlas magnéticamente sensibles (220) por medio de imanes (310a, 310b; 410a, 410b) dispuestos encima y debajo de la gotita inicial (218/222) con los polos opuestos enfrentados entre sí.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la gotita inicial (218/222) comprende una concentración inicial de la sustancia, y una o más operaciones de gotitas producen una gotita que comprende una concentración reducida de cantidad reducida de la sustancia con relación a la concentración inicial y a la cantidad inicial.

3. El método de la reivindicación 1, que además comprende realizar una o más operaciones de gotitas para fusionar una gotita de lavado con la gotita provista en la etapa 1 (a) para producir una gotita combinada.

4. El método de la reivindicación 1, que además comprende liberar o resuspender una o más de las perlas

(220) siguiendo la etapa 1 (c) .

5. El método de la reivindicación 4, que además comprende proporcionar un surfactante en la gotita que mejora la resuspensión con relación a la correspondiente gotita que carece de polímero hidrofílico.

6. El método de la reivindicación 4, que además comprende agitar una o más de las perlas (220) siguiendo la etapa 1 (c) usando un sonicador.

7. El método de la reivindicación 1, en el que:

(a) la etapa 1 (b) comprende situar una gotita que comprende las perlas (220) próximas a dichos imanes (310a, 310b; 410a, 410b) efectuando un campo magnético en las proximidades de uno o más de los electrodos (214) ; y

(b) la intensidad y localización del campo magnético son seccionadas para inmovilizar las perlas magnéticamente sensibles (220) en la gotita a una distancia de una zona de partición objetivo (224) que es suficiente para retener sustancialmente todas las perlas magnéticas (220) en una gotita (218) .

8. El método de la reivindicación 1, en el que:

(a) la etapa 1 (b) comprende situar una gotita que comprende las perlas (220) próxima a dichos imanes (310a, 310b; 410a, 410b) efectuando un campo magnético en las proximidades de uno o más de los electrodos (2014) ; y

(b) la posición de los imanes (310a, 310b; 410a, 410b) es seleccionada para situar centralmente las perlas magnéticas (220) a lo largo de una dimensión lateral de la gotita.

9. El método de la reivindicación 1, en el que:

(a) la etapa 1 (b) comprende situar una gotita que comprende las perlas (220) próximas a dichos imanes (310a, 310b; 410a, 410b) próximos a uno o más de los electrodos (214) ; y

(b) la localización del campo de los imanes (310a, 310b; 410a, 410b) es seccionada para situar centradamente las perlas magnéticas (220) a lo alargo de una dimensión vertical de la gotita.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa 1 (b) comprende inmovilizar magnéticamente la una o más perlas magnéticamente sensibles utilizando unos medios que comprenden:

(a) dichos imanes (310a, 310b; 410a, 410b) ; y

(b) unos medios para mover los imanes (310a, 310b; 410a, 410b) dentro y fuera de la proximidad del uno o más de los electrodos (214) .

11. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa 1 (c) se realiza mediante electrodos.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa 1 (c) se realiza mediante electromojado.

13. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa 1 (c) se realiza mediante dielectroforesis.

14. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa 1 (c) es mediante campo eléctrico.

15. El método de la reivindicación 1, en el que imanes adicionales (410c, 410d) están dispuestos de manera que son acoplados múltiples pares de imanes en posiciones que rodean la gotita inicial (218/222) con los polos opuestos enfrentados entre sí.