Detección de microorganismos con un dispositivo basado en fluorescencia.

Motodo para detectar crecimiento microbiano usando la deteccion de senales de fluorescencia en la bandadel visible generadas por al menos un compuesto quo fluoresce excitado mediante energia ultravioleta,

experimentando el compuesto que fluoresce transformación en presencia de crecimiento microbiano,comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar un recipiente que tiene (i) una matriz de barrera semifluida en el recipiente y (H) una capafluida adyacente a la matriz de barrera semifluida en el recipiente, en el que (A) la matriz de barrerasemifluida y la capa fluida comprenden ambas el al menos un compuesto que fluoresce, y (B) el recipientees al menos parcialmente transparente a la radiacion electromagnetica en los rangos de longitud de ondavisible y ultravioleta;

(b) exciter dicho al menos un compuesto quo fluoresce en la matriz de barrera semifluida con energiaultravioleta emitida desde un diodo emisor de luz que comprende longitudes de onda menores que 400nanómetros; y

(c) detectar una serial de fluorescencia en la banda del visible generada por dicho al menos un compuestoque fluoresce excitado en la matriz de barrera semifluida con al menos un detector de luz sensible a energiaelectromagnetica que comprende longitudes de onda mayores que o iguales a 400 nanometros.

Detección de microorganismos con un dispositivo basado en fluorescencia Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.' 60/592.166 presentada el 29 de julio de 2004, y la solicitud internacional n.' PCT/US05/04331, presentada el 11 de febrero de 2005, que se incorporan al presente documento como referencia.

La presente invención se refiere a dispositivos basados en fluorescencia para detectar crecimiento microbiano a partir de muestras de prueba.

Es necesario someter a prueba diversas sustancias industriales, tales como alimentos, productos farmacéuticos,

cosméticos yagua, para determinar contaminación microbiana. Un área de las pruebas biológicas de alimentos, productos lácteos, productos farmacéuticos, cosméticos y tipos relacionados de productos implica la estimación de los números totales de bacterias, levaduras y moho, asi como las concentraciones de grupos especificos de organismos dentro del material. Un método ampliamente usado se conoce como el método de "recuento en placa convencional" e implica cultivar una muestra diluida del producto en un medio de crecimiento de agar. Se incuban las placas que contienen la muestra y el medio de crecimiento (por ejemplo, 32'C -40'C) durante de 24 horas a 5 dias, dependiendo del ensayo. Tras la incubación, se cuentan las colonias de microorganismos que han crecido en el agar.

Se han usado satisfactoriamente métodos ópticos para clasificar microorganismos en muestras clinicas (por ejemplo, PASCO de Difco, Detroit, Michigan) . Aunque seria deseable utilizar un método colorimétrico, o cualquier

otro método óptico, para detectar crecimiento microbiano en muestras industriales, las sustancias sólidas de las muestras de prueba dispuestas en medios acuosos producen habitualmente interferencia óptica para un sistema de detección. Más específicamente, cuando se disponen sustancias sólidas en un medio para permitir el cultivo de microorganismos, el sistema de detección colorimétrico debe hacer pasar luz o bien a su través o bien reflejar luz procedente de los medios que contienen la sustancia sólida. En la mayoría de los casos, las sustancias sólidas interfieren con las características espectrales de los medios, proporcionando una mala relación señal-ruido del sistema de detección.

Se describe un dispositivo para monitorizar de manera continua la actividad biológica en una muestra por Eden en la patente estadounidense n.' 5.366.873. Describe un dispositivo y un método para detectar crecimiento microbiano a partir de una sustancia de muestra. El dispositivo incluye un recipiente un recipiente que es al menos parcialmente transparente y fiuido dispuesto en el recipiente para cultivar microorganismos en el mismo. Se dispone una sustancia indicadora en la capa fluida para experimentar transformación en presencia de crecimiento de microorganismos. Se dispone en el recipiente una segunda capa, compuesta por sustancia semifluida, indicadores y otras sustancias, tales como medios de crecimiento. Las sustancias dentro de la fase semifluida están en equilibrio con las sustancias en la capa fluida y proporcionan una barrera frente a las sustancias sólidas introducidas en la capa fiuida a la vez que proporcionan una zona dentro de la que pueden detectarse cambios en la sustancia indicadora, debido a crecimiento microbiano. En la práctica, la sustancia indicadora han sido colorantes que se ven afectados por las variaciones de pH en la capa fiuida.

El documento DE 100 38 080 A 1 se refiere a un método de registro de la presencia de sustancias inmovilizadas sobre un portador de biochip usando un aparato de exploración de fiuorascencia, en el que un láser pulsado excita marcas fiuorescentes que van a detectarse entre los pulsos. El aparato puede comprender un fotodiodo como sensor.

El documento "Portable, solid-state fiuorometer for the measurement of chlorophyll fiuorescent induction in plants" REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS USA, vol. 46, n.' 5, mayo de 1975 (05-1975) , páginas 538-542, de SCHREIBER U ET AL: se refiere a un aparato para medir la inducción de fiuorescencia de clorofila en plantas. El

instrumento se basa en una combinación de sensor-emisor que incluye un fototransistor en combinación con un diodo emisor de luz. Esta combinación está adaptada para detectar fiuorescencia y luz refiejada. Un LED emite luz relativamente monocromática con una longitud de onda pico a aproximadamente 670 nm y un fototransistor es sensible en la región de 800 -900 nm.

El documento WO 01/28006 se refiere a una fuente de excitación ultravioleta de alto rendimiento compuesta por uno o más LED emisores de ultravioleta. Tal fuente emisora de ultravioleta puede usarse para autentificar caracteristicas tanto visibles (marcas de agua) como invisibles (fiuorescentes ultravioletas) de un articulo en examen, comprendiendo además la fuente al menos un LED de luz blanca.

La presente invención proporciona un método para detectar crecimiento microbiano usando la detección de señales de fiuorescencia en la banda del visible generadas por al menos un compuesto que fiuoresce excitado mediante energía ultravioleta según las reivindicaciones independientes 1 y 18. La presente invención proporciona además un dispositivo para detectar crecimiento microbiano mediante la detección de señales de fluorescencia en la banda del visible generadas por al menos un compuesto que f1uoresce excitado mediante energía ultravioleta según la reivindicación independiente 19 y un dispositivo para detectar crecimiento microbiano mediante la detección de señales de fiuorescencia en la banda del visible y señales secundarias en la banda del visible generadas por al

menos un compuesto que fluoresee excitado mediante energía ultravioleta y en la banda del visible según la reivindicación independiente 38. Se definen realizaciones preferidas en las reivindicaciones dependientes.

Se apreciarán fácilmente las ventajas de la presente invención cuando se entiendan mejor las mismas mediante referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se considera en relación con los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1 muestra una realización de la presente invención; y

la figura 2 muestra otra realización de la presente invención.

En general, la presente invención proporciona un dispositivo para detectar crecimiento microbiano a partir de una sustancia de muestra, incluyendo el dispositivo al menos un recipiente que es al menos parcialmente transparente a radiación visible y/o ultravioleta (UV) . Se dispone una capa fluida en el recipiente para cultivar microorganismos en la misma. Se dispone una sustancia indicadora que fluoresee en la capa fluida para que experimente transformación en presencia de crecimiento de microorganismos. Se dispone una capa de barrera en el recipiente que es una sustancia semifluida, cuya parte fluida es de la misma composición que la capa fluida en la que se cultivan los microorganismos. Por tanto, el fluido en la capa semifluida está en equilibrio con la capa fluida. La sustancia semifluida proporciona una barrera frente a las sustancias sólidas introducidas en la capa fluida a la vez que proporciona una zona dentro de la que pueden detectarse cambios en la al menos una sustancia indicadora que fluoresce, debido a crecimiento microbiano.

Más específicamente, la capa de barrera se compone de agentes gelificantes, tales como agar. Al llevar a cabo la presente invención, puede utilizarse cualquier tipo de sustancia gelificante o agar, tal como se define en el índice Merck. Existen varios productos gelificantes comerciales disponibles que son adecuados, incluyendo gelatina,

carragenanos y pectina.

La importante propiedad de tales agentes gelificantes usados en la presente invención es su capacidad para transferir iones, tales como H' y moléculas pequeñas, a la vez que bloquean bacterias y partículas de desecho más grandes. Si la concentración de las partículas pequeñas cambia debido a crecimiento de organismos (por ejemplo,

pH o reacciones redox) , la concentración de las partículas idénticas en la capa de barrera también seguirá estos cambios. El coeficiente de difusión de la capa de barrera determina la tasa en la que se siguen las variaciones en la capa líquida por cambios idénticos en la capa de barrera.

La figura 1 ilustra una configuración típica de los diversos componentes de un sistema que puede utilizarse según esta invención. El vial 10 está compuesto por material transparente al UV (por ejemplo, vidrio, plásticos transparentes al UV) . La capa de barrera 16 puede componerse por cualquier agar disponible (por ejemplo, agar Muller Hinton de Difco, Detroit, Michigan) y colorante que fluoresee... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar crecimiento microbiano usando la detección de señales de fluorescencia en la banda del visible generadas por al menos un compuesto que fluoresee excitado mediante energía ultravioleta, experimentando el compuesto que fluoresce transformación en presencia de crecimiento microbiano, comprendiendo el método:

(a) proporcionar un recipiente que tiene (i) una matriz de barrera semifluida en el recipiente y (ii) una capa fluida adyacente a la matriz de barrera semifluida en el recipiente, en el que (A) la matriz de barrera semilluida y la capa fluida comprenden ambas el al menos un compuesto que Iluoresce, y (B) el recipiente es al menos parcialmente transparente a la radiación electromagnética en los rangos de longitud de onda visible y ultravioleta;

(b) excitar dicho al menos un compuesto que Iluoresce en la matriz de barrera semifluida con energía ultravioleta emitida desde un diodo emisor de luz que comprende longitudes de onda menores que 400

nanómetros; y

(c) detectar una señal de fluorescencia en la banda del visible generada por dicho al menos un compuesto que lIuoresee excitado en la matriz de barrera semilluida con al menos un detector de luz sensible a energía electromagnética que comprende longitudes de onda mayores que o iguales a 400 nanómetros.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho detector de luz es un fototransistor con sensibilidad

disminuida por debajo de una longitud de onda de 400 nanómetros.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un diodo emisor de luz genera un nivel estacionario de energía.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un diodo emisor de luz genera energía pulsada.

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un compuesto que fluorasee se elige de umbeliferonas y cumarinas.

6. Método según la reivindicación 1, en el que la capa fluida es un medio de crecimiento líquido para los microorganismos.

7. Método según la reivindicación 1, en el que la matriz de barrera semifluida comprende agar.

B. Método según la reivindicación 1, en el que la matriz de barrera semifluida comprende un agente gelificante seleccionado del grupo que consiste en gelatina, carragenanos y pectina.

9. Método según la reivindicación 6, en el que se hacen crecer células biológicas en dicha capa fluida.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dichas células biológicas son microorganismos.

11. Método según la reivindicación 10, en el que la matriz de barrera semifluida y la capa fluida comprenden además al menos un compuesto colorante visible de manera que dichos microorganismos hacen que dicho al menos un compuesto colorante visible emita una señal secundaria en la banda del visible cuando se expone a luz visible.

12. Método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un diodo emisor de luz y dicho al menos un detector de luz están enfrentados entre si.

13. Método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un diodo emisor de luz y dicho al menos un detector de luz están dispuestos formando un ángulo.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicho al menos un detector de luz detecta luz no directa generada por dicho al menos un diodo emisor de luz.

15. Método según la reivindicación 1, en el que no se emplea ningún filtro paso banda.

16. Método según la reivindicación 1, en el que una multiplicidad de compuestos que fluoreseen se excitan mediante una multiplicidad de diodos emisores de luz.

17. Método según la reivindicación 16, en el que se emplea una multiplicidad de recipientes. 1B. Método para detectar crecimiento microbiano usando la deteoción de señales de fluorescencia en la banda

del visible generadas por al menos un compuesto que fluoresce excitado mediante energía ultravioleta, experimentando el compuesto que fluoresce transformación en presencia de crecimiento microbiano,

comprendiendo el método:

(a) proporcionar un recipiente que tiene (i) una matriz de barrera semifluida en el recipiente y (ii) una capa fluida adyacente a la matriz de barrera semifluida en el recipiente, en el que (A) la matriz de barrera semifluida y la capa fluida comprenden ambas el al menos un compuesto que fluoresee, y (8) el recipiente es al menos parcialmente transparente a la radiación electromagnética en los rangos de longitud de onda visible y ultravioleta;

(b) excitar dicho al menos un compuesto que fluoresce en la matriz de barrera semifluida con energía ultravioleta; y

(c) detectar una señal de fluorescencia en la banda del visible generada por dicho al menos un compuesto que fluoresce excitado en la matriz de barrera semifluida con un detector de luz sensible a energía electromagnética que comprende longitudes de onda mayores que o iguales a 400 nanómetros.

19. Dispositivo para detectar crecimiento microbiano mediante la detección de señales de fluorescencia en la banda del visible generadas por al menos un compuesto que fluoresee excitado mediante energía ultravioleta, comprendiendo el dispositivo:

(a) un recipiente que tiene (i) una matriz de barrera semifluida en el recipiente y (ii) una capa fluida adyacente a la matriz de barrera semifluida en el recipiente, en el que (A) la matriz de barrera semifluida y la capa fluida comprenden ambas el al menos un compuesto que fluoresce, (8) el al menos un compuesto que f1uoresce experimenta transformación en presencia de crecimiento de microorganismos, y (C) el

recipiente es al menos parcialmente transparente a la radiación electromagnética en los rangos de longitud de onda visible y ultravioleta;

(b) al menos un diodo emisor de luz ultravioleta que genera radiación electromagnética que comprende longitudes de onda menores que 400 nanómetros y que puede excitar dicho al menos un compuesto que fluoresce en la matriz de barrera semifluida; y

(c) al menos un detector de luz sensible a energía electromagnética que comprende longitudes de onda mayores que o iguales a 400 nanómetros para la detección de señales de fluoreseencia en la banda del visible generadas por dicho al menos un compuesto que fluoresce en la matriz de barrera semifluida.

20. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que dicho detector de luz es un fototransistor con sensibilidad disminuida por debajo de una longitud de onda de 400 nanómetros.

21. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que dicho diodo emisor de luz genera un nivel estacionario de energía.

22. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que dicho diodo emisor de luz genera energía pulsada.

23. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que dicho al menos un compuesto que fluoresce se elige de umbeliferonas y cumarinas.

24. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que la capa fluida es un medio de crecimiento líquido para los microorganismos.

25. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que la matriz de barrera semifluida comprende agar.

26. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que la matriz de barrera semifluida comprende un agente gelificante seleccionado del grupo que consiste en gelatina, carragenanos y pectina.

27. Dispositivo según la reivindicación 24, en el que pueden hacerse crecer células biológicas en dicha capa fluida.

28. Dispositivo según la reivindicación 27, en el que dichas células biológicas son microorganismos.

29. Dispositivo según la reivindicación 28, en el que la matriz de barrera semifluida y la capa fluida comprenden además al menos un compuesto colorante visible de manera que dichos microorganismos hacen que dicho al menos un compuesto colorante visible emita una señal secundaria en la banda del visible cuando se expone a luz visible.

30. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que dicho al menos un diodo emisor de luz y dicho al menos un detector de luz están enfrentados entre sí.

31. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que dicho al menos un diodo emisor de luz y dicho al menos un

detector de luz están dispuestos formando un ángulo.

32. Dispositivo según la reivindicación 31, en el que dicho al menos un detector de luz detecta luz no directa generada por dicho al menos un diodo emisor de luz.

33. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que una multiplicidad de compuestos que fluorescen se excitan mediante una multiplicidad de diodos emisores de luz.

34. Dispositivo según la reivindicación 33, en el que se emplea una multiplicidad de recipientes.

35. Dispositivo según la reivindicación 19, en el que no se emplea ningún filtro paso banda.

36. Dispositivo según la reivindicación 19, que comprende además al menos un filtro paso banda ubicado en la trayectoria de dicha radiación electromagnética delante de una zona sensible a la luz de dicho al menos un detector de luz.

37. Instrumento para mediciones simultáneas de una multiplicidad de compuestos que fluorescen, que comprende múltiples unidades que comprenden cada una el dispositivo según la reivindicación 19.

38. Dispositivo para detectar crecimiento microbiano mediante la detección de señales de fluorescencia en la banda del visible y señales secundarias en la banda del visible generadas por al menos un compuesto que fluoresce excitado mediante energía ultravioleta y en la banda del visible, comprendiendo el dispositivo:

(a) un recipiente que tiene (i) una matriz de barrera semifluida en el recipiente y (ii) una capa fluida adyacente a la matriz de barrera semifluida en el recipiente, en el que (A) la matriz de barrera semifluida y la capa fluida comprenden ambas el al menos un compuesto que fluoresce, (B) el al menos un compuesto que fluoresee experimenta transformación en presencia de crecimiento de microorganismos, (C) el

recipiente es al menos parcialmente transparente a la radiación electromagnética en los rangos de longitud de onda visible y ultravioleta, (D) la matriz de barrera semifluida y la capa fluida comprenden ambas al

menos un compuesto colorante visible y (E) el al menos un compuesto colorante visible experimenta transformación en presencia de crecimiento de microorganismos;

(b) al menos un diodo emisor de luz ultravioleta que genera radiación electromagnética que comprende longitudes de onda menores que 400 nanómetros, pudiendo dicho al menos un diodo emisor de luz ultravioleta excitar dicho al menos un compuesto que fluoresee en la matriz de barrera semifluida,

generando de ese modo dicha señal de fluorescencia en la banda del visible;

(e) al menos un diodo emisor de luz en la banda del visible que genera radiación electromagnética que comprende longitudes de onda mayores que o iguales a 400 nanómetros, pudiendo dicho al menos un diodo emisor de luz en la banda del visible interaccionar con al menos un compuesto colorante visible en la matriz de barrera semi fluida, generando de ese modo dicha señal secundarla en la banda del visible;

(d) al menos un detector de luz sensible a energía electromagnética que comprende longitudes de onda mayores que o iguales a 400 nanómetros para detectar dicha señal de fluorescencia en la banda del visible y dicha señal secundaria en la banda del visible.