Procedimiento y dispositivo destinado a la obtención por microscopía de imagenes en tres dimensiones de una muestra.

Procedimiento para obtener por microscopía imágenes en tres dimensiones de una muestra,

en particular unamuestra biológica espesa, y del campo de fluorescencia emitido por dicha muestra, caracterizado porquecomprende:

una etapa de medición y registro, durante la cual se mide y registra de manera secuencial e independiente,por una parte las señales interferométricas obtenidas por holografía digital y, por otra las señales defluorescencia, resultante de la muestra;

una etapa de tratamiento, en curso de la cual se combinan las citadas señales interferométricas obtenidaspor holografía digital y las citadas señales de fluorescencia así registradas, con el fin de reconstruirimágenes nítidas, en tres dimensiones, de la muestra en sí misma y del campo de fluorescencia emitido porla muestra en un momento dado.

Procedimiento y dispositivo destinados a la obtención por microscopía de imágenes en tres dimensiones de una muesta.

La presente invención concierne a un procedimiento y un dispositivo que permiten obtener por microscopía imágenes en tres dimensiones de una muestra y obtener en tres dimensiones del campo de florescencia emitido por dicha muestra, siendo previamente marcada esta muestra fluorescente con la ayuda de uno o varios fluorocromos.

Una de las aplicaciones de dicho procedimiento y de dicho dispositivo concierne, más particularmente, a la obtención de imágenes en tres dimensiones de la fluorescencia emitida por las muestras biológicas que pueden ser de espesor, para observar su comportamiento dinámico y su evolución en el tiempo.

Estado de la Técnica La microscopía de fluorescencia clásica supuso un progreso decisivo en el campo de la biología. En particular, la técnica de la inmunofluorescencia ha permitido realizar el marcaje específico de moléculas y su localización en los tejidos. Por otro lado, el descubrimiento de las GFP, las "proteínas verdes fluorescentes", revolucionó el estudio de la localización, de la dinámica y de las interacciones de las proteínas en las células vivas.

Sin embargo, uno de los problemas encontrados en la microscopía fluorescente clásica reside en la fluorescencia emitida por los elementos situados fuera del plano de nitidez. Esta luz parásita impide una buena lectura de la imagen, añadiendo un ruido de fondo importante. Las imágenes resultan muy dificiles de interpretar cuando se observa olas muestras biológicas de espesor, como los embriones.

La microscopía confocal permite, mientras tanto, evitar este problema realizando una excitación de la fluorescencia de la muestra en una zona de muy pequeñas dimensiones, la cual barre la muestra, y el bloqueo por una pequeña abertura de la fluorescencia emitida fuera de la zona iluminada.

No obstante, la microscopía confocal presenta también sus propios inconvenientes.

Un primer inconveniente de la microscopía confocal es que dicha técnica requiere el barrido completo de la muestra por un dispositivo óptico-mecánico. Esta operación requiere de un tiempo relativamente importante para analizar un volumen (típicamente, del orden de unos segundos) antes de que la imagen esté disponible para su visualización.

Por otro lado, la fuerza excitatoria utilizada en microscopía confocal es generalmente un láser Argón ó Argón-Kriptón que pueda dañar las muestras biológicas.

Otro inconveniente es que las fuerzas excitatorias no permiten cubrir fácilmente toda la gama de longitudes de onda necesarias para la observación en fluorescencia.

Finalmente, la microscopía confocal es una técnica extremadamente sofisticada que requiere una gran precisión al manipularla y que también resulta costosa económicamente.

El documento US 6 038 041 propone una técnica alternativa a la microscopía de fluorescencia holográfica y describe un sistema óptico por barrido destinado a reconstruir la fluorescencia en tres dimensiones proveniente de una muestra. Por eso, barriendo la muestra con una figura de interferencia concreta en la zona de Fresnel, de acuerdo con un barrido de dos dimensiones, se detecta y luego analiza la luz fluorescente proveniente de la muestra.

Objeto de la invención La presente invención está diseñada para proporcionar un procedimiento y un dispositivo que permitan obtener, por microscopía, imágenes en tres dimensiones y medir en tres dimensiones la fluorescencia emitida por una muestra, en particular una muestra espesa, y que no presente los inconvenientes de las técnicas de microscopía clásicas, incluyendo los de la microscopía confocal.

En particular, la presente pretende proporcionar un procedimiento y un dispositivo que permitan, al mismo tiempo, obtener imágenes en tres dimensiones de la muestra y del campo de fluorescencia de esta muestra; es decir, obtener información sobre la repartición de la fluorescencia a lo largo del volumen de la muestra, y eventualmente seguir su evolución en el tiempo, con un desfase de tiempo mínimo entre cada toma de imágenes.

Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento y un dispositivo que no necesiten una manipulación muy compleja y cuyo coste sea competitivo, especialmente con respecto a la microscopía confocal.

Resumen de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento y a un dispositivo que permitan obtener imágenes en tres dimensiones de una muestra, preferentemente una muestra biológica espesa, y obtener el campo de fluorescencia en tres dimensiones emitido por dicha muestra mediante la conexión de señales interferométricas obtenidas por holografia digital y señales de fluorescencia.

Por "muestra espesa" se entiende una muestra cuyas dimensiones son tales que es imposible tener una imagen nitida sobre toda la profundidad de la muestra por un procedimiento de microscopía clásica.

En realidad, un primer objeto de la presente invención consiste en un procedimiento para obtener, por microscopía, imágenes en tres dimensiones de una muestra, en particular una muestra biológica espesa, y del campo de fluorescencia emitido por dicha muestra, caracterizado porque comprende:

una etapa de medición y registro, durante la cual se mide y registra de manera secuencial e independiente, por una parte las señales interferométricas obtenidas por holografía digital y, por otra las señales de fluorescencia, resultante de la muestra; una etapa de tratamiento, en curso de la cual se combinan las citadas señales interferométricas obtenidas por holografia digital y las citadas señales de fluorescencia así registradas, con el fin de reconstruir imágenes nítidas, en tres dimensiones, de la muestra en sí misma y del campo de fluorescencia emitido por la muestra en un momento dado.

De preferencia, se repiten en el tiempo dichas etapas de medición y registro, y de tratamiento, de modo que sigan la evolución de las imágenes en tres dimensiones de la muestra y el campo de fluorescencia de dicha muestra.

De manera ventajosa, la combinación de las señales interferométricas obtenidas por holografía digital y de las señales de fluorescencia para reconstruir las imágines nítidas en tres dimensiones de la muestra en estudio y del

campo de fluorescencia de dicha muestra, se realiza mediante análisis numérico.

Un segundo objeto de la presente invención pretende proporcionar un dispositivo para la implementación del procedimiento arriba descrito, el cual comprende un microscopio funcionando en holografía digital, combinado con una fuerza de excitación de la fluorescencia.

De preferencia, la fuerza de excitación de la fluorescencia funciona en modo de reflexión o de transmisión.

Ventajosamente, el microscopio que funciona en holografía digital comprende una fuente de luz parcialmente coherente, o eventualmente coherente, funcionando en transmisión y que es capaz de generar una fuente de haz de luz.

Según una primera realización preferida de la invención, la fuente de luz parcialmente coherente de dicho microscopio comprende los siguientes elementos: una fuente emisora de luz de longitud espectral reducida, una primera lente, una primera abertura, una segunda lente, una segunda abertura y una tercera lente, siendo tal la disposición relativa de estos diferentes elementos que cuando la fuente opera, la luz emitida por la fuente emisora de luz encuentra sucesivamente la primera lente, la primera abertura, la segunda lente, la segunda abertura y la tercera lente y la luz en la salida de la tercera lente es una luz colimada.

Según otra realización preferida de la invención, la fuente de luz parcialmente coherente del citado microscopio comprende los siguientes elementos:

una fuente emisora de luz de longitud espectral reducida, una fibra óptica, una primera lente, una segunda lente, una tercera lente y una abertura con apertura ajustable, siendo tal la disposición relativa de estos diferentes elementos que cuando la fuente opera, la luz emitida por la fuente emisora de luz pasa primero a través de la fibra óptica a fin de tener un campo luminoso homogéneo, posteriormente encuentra la primera lente, luego la segunda y la tercera lente para obtener una luz colimada sobre la abertura.

Según otra realización preferida de la invención, la fuente de luz parcialmente coherente del citado microscopio comprende los siguientes elementos:

una fuente láser, una primera lente, un difusor giratorio, una segunda lente y una abertura, siendo tal la disposición relativa de estos diferentes elementos que cuando la fuente opera, el haz láser emitido... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para obtener por microscopía imágenes en tres dimensiones de una muestra, en particular una muestra biológica espesa, y del campo de fluorescencia emitido por dicha muestra, caracterizado porque comprende:

una etapa de medición y registro, durante la cual se mide y registra de manera secuencial e independiente, por una parte las señales interferométricas obtenidas por holografía digital y, por otra las señales de fluorescencia, resultante de la muestra; una etapa de tratamiento, en curso de la cual se combinan las citadas señales interferométricas obtenidas por holografía digital y las citadas señales de fluorescencia así registradas, con el fin de reconstruir imágenes nítidas, en tres dimensiones, de la muestra en sí misma y del campo de fluorescencia emitido por la muestra en un momento dado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se repiten en el tiempo dichas etapas de medición y registro, y de tratamiento, de modo que sigan la evolución de las imágenes en tres dimensiones de la muestra y el campo de fluorescencia de dicha muestra.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la combinación de las señales interferométricas obtenidas por holografía digital y de las señales de fluorescencia para reconstruir las imágines nítidas en tres dimensiones de la muestra en estudio y del campo de fluorescencia de dicha muestra, se realiza mediante análisis numérico.

4. Dispositivo adaptado a la puesta en funcionamiento del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque incluye un microscopio funcionando en holografía digital, combinado con una fuente de excitación de la fluorescencia.

5. Dispositivo según la reivindicación 4, caracterizado porque la fuente de excitación de la fluorescencia funciona en modo de reflexión o transmisión.

6. Dispositivo según la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque el microscopio que funciona en holografía digital comprende una fuente de luz parcialmente coherente, o eventualmente coherente, funcionando en transmisión y que es capaz de generar una fuente de haz de luz.

7. Dispositivo según la reivindicación 6, caracterizado porque la fuente de luz parcialmente coherente del citado microscopio comprende los siguientes elementos:

una fuente emisora de luz de longitud espectral reducida (S) , una primera lente (L1) , una primera abertura (A1) , una segunda lente (L2) , una segunda abertura (A2) y una tercera lente (L3) , siendo tal la disposición relativa de estos diferentes elementos que cuando la fuente opera, la luz emitida por la fuente emisora de luz encuentra sucesivamente la primera lente (L1) , la primera abertura (A1) , la segunda lente (L2) , la segunda abertura (A2) y la tercera lente (L3) y la luz en la salida de la tercera lente es una luz colimada.

8. Dispositivo según la reivindicación 6, caracterizado porque la fuente de luz parcialmente coherente del citado microscopio comprende los siguientes elementos:

una fuente emisora de luz de longitud espectral reducida (S) , una fibra óptica, una primera lente (L 1) , una segunda lente (L2) , una tercera lente (L3) y una abertura (A1) con apertura ajustable, siendo talla disposición relativa de estos diferentes elementos que cuando la fuente opera, la luz emitida por la fuente emisora de luz pasa primero a través de la fibra óptica a fin de tener un campo luminoso homogéneo, posteriormente encuentra la primera lente (L1) , luego la segunda (L2) y la tercera lente (L3) para obtener una luz colimada sobre la abertura (A1) .

9. Dispositivo según la reivindicación 6, caracterizado porque la fuente de luz parcialmente coherente del citado microscopio comprende los siguientes elementos:

una fuente láser (S) , una primera lente (L 1) , un difusor giratorio (D) , una segunda lente (L2) y una abertura (A) , siendo tal la disposición relativa de estos diferentes elementos que cuando la fuente opera, el haz láser emitido por la fuente láser encuentra en primer lugar la primera lente (L 1) , luego el difusor giratorio (D) que está situado detrás el punto focal de la citada primera lente (L 1) , posteriormente la segunda lente (L2) situada en la distancia focal con respecto al plano del difusor giratorio (D) , y finalmente la citada abertura (A) .

10. Dispositivo según la reivindicación 6, caracterizado porque la fuente de luz parcialmente coherente del citado microscopio comprende los siguientes elementos:

una fuente láser (S) , una primera lente (L 1) , un difusor giratorio (D) tal como vidrio esmerilado, y una segunda lente (L2) , siendo tal la disposición relativa de estos diferentes elementos que cuando la fuente opera, el haz láser emitido por la fuente láser pasa primero a través de la primera lente (L 1) , luego del difusor (D) y luego de la segunda lente (L2) , estando el haz láser de salida de la primera lente (L 1) focalizado en un punto de focalización situado aguas arriba del difusor a una distancia (d) regulable del mismo (D) .

11. Dispositivo según una de las reivindicaciones 4 a 10, en el que el microscopio que funciona en holografía digital comprende además:

un primer subconjunto (SE1) , móvil, comprendiendo un separador de haz (8S1) y un espejo (M1) , para formar dos haces paralelos, un haz objeto (O) y un haz de referencia (R) a partir de la fuente de haz luminosa; medios (M) , preferentemente espejos, para dirigir la fuente de haz luminosa sobre el primer subconjunto (SE1) , del separador de haz (8S1) ; un segundo subconjunto (SE2) , fijo o móvil, que comprende igualmente un separador de haz (8S2) y un espejo (M2) , para combinar dicho haz objeto (O) y dicho haz de referencia (R) en un haz luminoso recombinado; una célula objeto (So) que comprende una muestra a estudiar, dispuesta sobre el trayecto óptico del haz objeto (O) entre el primer (SE1) y el segundo subconjunto (SE2) ; un primer objetivo del microscopio (ML 1) , sobre el trayecto óptico del haz objeto (O) entre el primer (SE1) y el segundo subconjunto (SE2) , aguas debajo de la célula objeto (So) ; medios de compensación del trayecto óptico, dispuestos sobre el trayecto óptico del haz de referencia (R) entre el primer (SE1) y el segundo subconjunto (SE2) ; un segundo objetivo del microscopio (ML2) , dispuesto sobre el trayecto óptico del haz de referencia (R) entre el primer (SE1) y el segundo subconjunto (SE2) , aguas debajo de los citados medios de compensación del trayecto óptico; primeros medios de focalización (L4) capaces de focal izar el haz objeto (O) sobre la célula objeto (So) ; segundos medios de focalización (L5) capaces de focalizar el haz de referencia (R) sobre los citados medios de compensación del trayecto óptico.

12. Dispositivo según la reivindicación 11 f caracterizado porque los citados medios de compensación del trayecto óptico comprenden una célula de referencia (Sr) comparable con la célula objeto (So) aunque no comprenden la muestra a estudiar.

13. Dispositivo según la reivindicación 11, caracterizado porque los citados medios de compensación del trayecto óptico comprenden un material transparente de espesor y composición adecuada.

14. Dispositivo según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende además unos medios de registro y tratamiento, tal como preferentemente una cámara CCD acoplada a medios informáticos de tratamiento y análisis de imágenes, pueden igualmente estar previstos para registrar y tratar las mencionadas señales interferométricas y de fluorescencia, así como medios de focalización adicionales (L6) para focalizar el citado haz luminosos recombinado sobre los citados medios de registro (C) .

Al A2

FIG. 1

Al

L3 L2 L1

FIG. 2

o s FIG. 3

s L1 D t2

d

Al

. L3

SE! SE2

FIG.5